趙明禮 ，郝少強(qiáng) ，王 娜 ，郭 晶 ，郭春明 ，許彩華 ，于 清 ，李 嬌 ，王小武 *，馬 毅

（1.天津中科博雅生物育種研究有限公司，天津 300347；2.天津夢得集團(tuán)有限公司，天津300400；3.全國畜牧總站，北京 100193；4.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381）

和牛是國際公認(rèn)品質(zhì)最優(yōu)良的肉牛品種，引入中國后多以雜交改良的方式進(jìn)行商業(yè)推廣，缺乏系統(tǒng)性的繁育體系，導(dǎo)致純種存欄量低，雜交品種繁雜。超數(shù)排卵-胚胎移植又稱體內(nèi)胚胎生產(chǎn)，是發(fā)展最早、應(yīng)用最廣的胚胎生物技術(shù)，是良種肉?？焖贁U(kuò)繁的有效技術(shù)手段[1]，對我國和牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。國內(nèi)外學(xué)者針對體內(nèi)胚胎生產(chǎn)技術(shù)開展了大量研究，主要圍繞在激素種類、供體年齡、超排季節(jié)、處理頻次等方面[2-4]，但在供體牛篩選標(biāo)準(zhǔn)上的研究較少。近年來，國外學(xué)者指出血液中抗繆勒管激素可以用來預(yù)測超排效果[5]，這在國內(nèi)也得到了驗證[6]。但對于大多數(shù)牧場而言，測定血液中抗繆勒管激素濃度需要借助第三方檢測公司，具有不可控性、費用高及檢測周期長等缺陷，因此，不適宜作為商業(yè)化體內(nèi)胚胎生產(chǎn)供體牛的篩選標(biāo)準(zhǔn)。隨著超聲影像技術(shù)在牛場的廣泛應(yīng)用，通過B超檢查卵巢上的有腔卵泡數(shù)可以更直觀反映供體牛的卵巢活性。目前，國內(nèi)尚無卵泡數(shù)對供體牛超排效果影響的相關(guān)報道。本實驗通過B超檢查超排前供體牛兩側(cè)卵巢上直徑為3～5 mm的有腔卵泡數(shù)，研究有腔卵泡數(shù)對超排效果的影響，以期優(yōu)化體內(nèi)胚胎生產(chǎn)供體牛篩選標(biāo)準(zhǔn)，為建立和牛高效擴(kuò)繁技術(shù)體系提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗?zāi)概樘旖蛑锌撇┭派镉N研究有限公司良繁場提供的16～18月齡青年黑毛和牛（Fullblood Wagyu），所有牛只系譜信息完整，發(fā)情周期正常，體況適中，經(jīng)直腸檢查生殖器官正常，無繁殖疾病。精液為內(nèi)蒙古賽科星精源科技有限公司同批次生產(chǎn)，經(jīng)抽檢，符合國標(biāo)《牛冷凍精液》（GB 4143-2008）質(zhì)量要求。

1.2 試劑 維生素ADE（5 mL/支，維生素A 25萬單位+維生素D 2.5萬單位）為西鄉(xiāng)長江動物藥品有限責(zé)任公司生產(chǎn)；氯前列烯醇（PG，0.322 mg/支）為齊魯動物保健品有限公司生產(chǎn)；孕酮陰道栓（CIDR，1.56 g孕酮/支）、促卵泡素（FSH，F(xiàn)olltropin-V，稀釋后20 mL/瓶，含NIH-FSH-P1 20 mg/mL）、沖胚液（Flush）、保存液（Holding）均來自于法國Vetoquinol公司；促黃體素釋放激素（LHRH-A3，促排3號，25 μg/支）為寧波市三生藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組 選擇68頭青年黑毛和牛作為供體，超排處理前使用獸用B超（型號Easi-Scan Micro-Convex，英國BCF公司）檢查兩側(cè)卵巢上直徑為3～5 mm的有腔卵泡數(shù)，以卵泡總數(shù)10和20為臨界值將其分為3組，I、Ⅱ、Ⅲ組有腔卵泡數(shù)分別為＜10、10～19、≥20個（表1）。

表1 不同組間供體牛超排前有腔卵泡數(shù)

1.3.2 超排處理及人工授精 采用CIDR+FSH+PG的超排方法，即在供體牛發(fā)情間期的任意一天上午埋植孕酮陰道栓（CIDR）（埋植當(dāng)天計為第0天），并肌肉注射2支維生素ADE，第5天到第8天連續(xù)在每天07:00、19:00分2次肌肉注射促卵泡激素（FSH），4 d的劑量分別為2、1.5、1、0.5 mL/次（總劑量10 mL），第7天上午注射FSH的同時，注射2支前列腺素（PG），下午注射FSH的同時，注射1支PG并撤出CIDR。第9天觀察發(fā)情，供體發(fā)情后8～12 h進(jìn)行第1次人工授精，同時肌肉注射2支促排3號，間隔12 h后進(jìn)行第2次人工授精，每次使用1支細(xì)管凍精。

1.3.3 胚胎回收及質(zhì)量鑒定 第1次人工授精后7 d采用非手術(shù)法回收胚胎。根據(jù)卵巢反應(yīng)情況，每側(cè)子宮角反復(fù)沖洗6～8次?；厥找航?jīng)集卵杯過濾后，使用沖胚液反復(fù)沖洗側(cè)壁濾膜3～5次，避免胚胎沾附在濾膜上，待回收液相對清亮后，放置到體視顯微鏡下確定胚胎質(zhì)量。胚胎質(zhì)量鑒定標(biāo)準(zhǔn)參考國家標(biāo)準(zhǔn)《牛胚胎》（GB/T 25881-2010）。

1.3.4 測定指標(biāo) 不同試驗組間供體牛黃體數(shù)、回收胚胎數(shù)、可用胚胎數(shù)、回收效率（回收胚胎數(shù)/黃體總數(shù)）、胚胎可用率（可用胚胎數(shù)/回收胚胎數(shù)）、退化率（退化胚數(shù)/回收胚胎數(shù)）以及未受精率（未受精卵數(shù)/回收胚胎數(shù)）等指標(biāo)。

1.4 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)用SAS 9.2軟件單因子方差分析進(jìn)行差異顯著性分析，多重比較采用Duncan′s法，并對超排前卵泡數(shù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 供體牛超排前有腔卵泡數(shù)正態(tài)分布檢驗結(jié)果 通過B超檢查供體牛超排前3～5 mm的有腔卵泡數(shù)為6～28個，平均為15個，經(jīng)SAS正態(tài)分布檢驗，供體牛超排前有腔卵泡數(shù)符合正態(tài)分布（圖1）。

圖1 供體牛超排前有腔卵泡數(shù)正態(tài)分布直方圖

2.2 不同有腔卵泡數(shù)供體牛體內(nèi)胚胎回收結(jié)果 由表2可知，Ⅲ組供體牛黃體數(shù)、回收胚胎數(shù)、可用胚胎數(shù)顯著高于其他2組（P＜0.05），Ⅱ組供體牛黃體數(shù)、回收胚胎數(shù)、可用胚胎數(shù)顯著高于I組（P＜0.05）；Ⅲ組供體牛的退化胚數(shù)、退化率顯著高于其他2組（P＜0.05）。3個組間的回收效率和未受精率無顯著差異（P＞0.05）；Ⅲ組供體牛的胚胎可用率顯著低于I組（P＜0.05）。

3 討 論

初情期后或產(chǎn)后未妊娠母牛卵巢上卵泡和黃體呈現(xiàn)周期性變化，受下丘腦-垂體-卵巢生殖軸的反饋調(diào)節(jié)。每個卵泡發(fā)育波開始出現(xiàn)前，下丘腦分泌促性腺激素釋放激素增加，促進(jìn)垂體 FSH 合成和分泌，F(xiàn)SH促進(jìn)卵巢上小的有腔卵泡發(fā)育，卵泡在發(fā)育過程中不斷分泌雌激素，反作用于生殖調(diào)控軸抑制FSH的分泌，在較低FSH濃度下直徑達(dá)到8 mm的有腔卵泡仍然可以繼續(xù)發(fā)育成為優(yōu)勢卵泡，如果此時無黃體存在，優(yōu)勢卵泡將繼續(xù)發(fā)育成熟，破裂排卵，而其他體積較小的有腔卵泡在較低FSH濃度下不能繼續(xù)生長，如果此時給予外源FSH持續(xù)性刺激，小的有腔卵泡也可以生長發(fā)育，出現(xiàn)多卵成熟并排卵的現(xiàn)象。然而，有腔卵泡的發(fā)育潛力取決于不同個體原始卵泡的多少。研究表明，不同青年母牛原始卵泡總數(shù)在60 000～240 000，表現(xiàn)在后期每個卵泡發(fā)育波中有腔卵泡的差異高達(dá)6～7倍[7]，即供體牛不同原始卵泡水平影響后期的卵泡發(fā)育潛力，進(jìn)而影響超排效果。本實驗首次在國內(nèi)采用更直觀的方式監(jiān)測不同供體牛的卵巢活性，即通過B超檢測卵巢有腔卵泡數(shù)，研究有腔卵泡數(shù)對供體牛超排效果的影響，結(jié)果表明，供體牛超排前有腔卵泡數(shù)在6～28個，平均為15個，呈正態(tài)分布，隨著供體牛超排前有腔卵泡數(shù)增多，黃體數(shù)、回收胚胎數(shù)及可用胚胎數(shù)隨之增多，與Center等[5]的研究結(jié)果一致，說明超排前有腔卵泡數(shù)可以作為供體牛的篩選標(biāo)準(zhǔn)之一。本研究結(jié)果也表明，隨著回收胚胎數(shù)增多，胚胎可用率有降低趨勢，退化率有增加趨勢，這在畢江華等[8]的研究數(shù)據(jù)中也有類似現(xiàn)象，這可能是因為在外源FSH誘導(dǎo)下過多的有腔卵泡同時發(fā)育成熟并排卵，影響卵母細(xì)胞質(zhì)量，雖然能夠成功受精，但后期胚胎發(fā)育能力下降，進(jìn)而導(dǎo)致退化率升高，但具體機(jī)理尚未見報道，有待下一步研究探索。

綜上所述，有腔卵泡數(shù)可以作為供體牛的篩選標(biāo)準(zhǔn)之一。