羅茂梅，蔡善君

0引言

年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，ARMD)是發(fā)達(dá)國(guó)家55歲以上人群的主要致盲原因，其病因被認(rèn)為是由多種因素引起的，包括持續(xù)氧化應(yīng)激、慢性炎癥、遺傳和環(huán)境易感因素等[1]。ARMD的患者數(shù)以百萬(wàn)計(jì)，并且可能隨著人口壽命的延長(zhǎng)而增加[2]。ARMD能影響患者黃斑，導(dǎo)致中心視力喪失，嚴(yán)重影響患者的閱讀、看電視或駕車的能力[3]。大約90% ARMD患者病程緩慢進(jìn)展，稱為干性ARMD，特點(diǎn)是進(jìn)行性色素上皮萎縮，然而該疾病可以轉(zhuǎn)變?yōu)楦鼑?yán)重的形式，稱為濕性ARMD，特點(diǎn)是脈絡(luò)膜新生血管，引起一系列出血、滲出和瘢痕改變，它是ARMD導(dǎo)致視力喪失的主要因素。導(dǎo)致ARMD發(fā)展以及從干性向濕性轉(zhuǎn)變的機(jī)制尚不清楚，雖然這種疾病的治療方案越來(lái)越多，但是目前還沒有有效的治療方法。脂褐素(有時(shí)稱為“老化色素”)是細(xì)胞內(nèi)的熒光色素顆粒，主要積聚在有絲分裂后細(xì)胞，如神經(jīng)元細(xì)胞、心肌細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細(xì)胞[4]。脂褐素隨著年齡增長(zhǎng)而緩慢積累，一般來(lái)說(shuō)它是氧化的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物、金屬(主要是鐵)和其他有機(jī)分子的混合物，但是這種混合物因來(lái)源的組織而異[5]。脂褐素對(duì)細(xì)胞功能的作用目前還不清楚，但人們普遍認(rèn)為，脂褐素的積累會(huì)增加機(jī)體對(duì)氧化應(yīng)激的易感性，降低溶酶體的降解能力，RPE細(xì)胞中脂褐素隨著年齡增長(zhǎng)的聚積也被認(rèn)為是ARMD的主要危險(xiǎn)因素。

1脂褐素的形成與組成

脂褐素隨著年齡的增長(zhǎng)而逐漸積累，是在多種病理生理?xiàng)l件下形成的，如氧化應(yīng)激和老化，其基本特征是蛋白質(zhì)損傷和清除之間的不平衡，導(dǎo)致蛋白質(zhì)內(nèi)穩(wěn)態(tài)失調(diào)，氧化蛋白質(zhì)聚集體積累，隨后高交聯(lián)材料如脂褐素和類脂褐素脂質(zhì)體積累，影響細(xì)胞活力[6]。因此，脂褐素被看作是吞噬和自噬過(guò)程中未被消化的細(xì)胞物質(zhì)的聚集體，作為內(nèi)質(zhì)顆粒堆積[6]。在RPE中形成的脂褐素主要來(lái)源于RPE細(xì)胞吞噬光感受器外段脫落的膜盤，被吞噬的膜盤在溶酶體內(nèi)未被完全消化，殘留物便聚積形成脂褐素。正常人視網(wǎng)膜后極部脂褐素濃度最高，中央凹脂褐素含量最少，維持終身不變，這與視網(wǎng)膜的局部功能和視桿細(xì)胞分布是相對(duì)應(yīng)的[7]。在一位80歲患者的RPE細(xì)胞中脂褐素約占細(xì)胞體積的19%。導(dǎo)致脂褐素積累的增加可能與光照、RPE65以及基因突變致ABCR活性減低有關(guān)。光照會(huì)引起全反式視黃醛釋放過(guò)多的脂褐素前體，而光感受器間的視黃醇結(jié)合蛋白可以在視桿外段清除全反式視黃醇和視黃醛，防止脂褐素前體的形成，但不能去除已經(jīng)存在的前體。據(jù)報(bào)道，溶酶體酸化可以防止ARMD患者受損的RPE細(xì)胞堆積脂褐素[8]；Hohn等[9]認(rèn)為自噬體和溶酶體并非強(qiáng)制性地參與脂褐素形成，而是充當(dāng)此類生物分子聚集的儲(chǔ)存場(chǎng)所，從而有助于減輕其細(xì)胞毒性；Ureshino等[10]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)脂褐素積累會(huì)損害巨噬細(xì)胞的自噬能力。最新研究表明脂褐素形成可以發(fā)生在溶酶體室外，并且獨(dú)立于巨噬細(xì)胞吞噬過(guò)程，這是由于在衰老過(guò)程中有絲分裂和自噬普遍減少，但脂褐素的形成卻仍然增加，線粒體裂變的抑制和線粒體蛋白質(zhì)的持續(xù)氧化是年齡相關(guān)的脂褐素形成的重要因素[11]。

從RPE脂褐素中分離出的第一個(gè)化合物是N-亞視黃基-N-視黃基乙醇胺(A2E)，它是脂褐素的主要成分，屬于類視黃醇家族，通過(guò)NADPH氧化酶催化產(chǎn)生超氧化物而具有毒性，導(dǎo)致RPE細(xì)胞死亡[12]。A2E具有特殊的楔型結(jié)構(gòu)，由一個(gè)獨(dú)特的吡啶極性頭基團(tuán)和兩個(gè)疏水的維甲酸尾組成，因此不易被溶酶體酶識(shí)別難于被降解。A2E的生物合成是一種多步驟過(guò)程：包括視錐和視桿細(xì)胞吸收光，產(chǎn)生全反式視黃醛，兩分子全反式視黃醛與一分子乙醇胺反應(yīng)形成N-亞視黃基-N-視黃基-磷脂酰乙醇胺(A2PE-H2)，然后A2PE-H2被氧化為A2PE，它是A2E的直接前體，當(dāng)光感受器脫落的膜盤被RPE細(xì)胞吞噬后，在溶酶體內(nèi)酶切形成A2E[13]。視循環(huán)過(guò)程中產(chǎn)生過(guò)多的11-順式視黃醛也可在視桿細(xì)胞中直接形成A2PE[14]。由于光感受器外段的完全替換約10d，A2PE便不連續(xù)地積累在感光細(xì)胞，因此防止A2PE的積累有助于外段膜的不斷更新。A2E可被體外合成且已廣泛用于研究，探討其參與視網(wǎng)膜隨著老化而發(fā)生的破壞性過(guò)程。A2E大致分布規(guī)律在遠(yuǎn)周最高，向中心下降[13]。

2 RPE細(xì)胞脂褐素的自發(fā)熒光特性

RPE細(xì)胞聚集的脂褐素是眼底自發(fā)熒光的來(lái)源，其成分復(fù)雜，含有20多個(gè)熒光團(tuán)，主要是類視色素二聚體及其光氧化和光降解產(chǎn)物[15]。在人視網(wǎng)膜組織切片中記錄RPE脂褐素?zé)晒?，發(fā)現(xiàn)其信號(hào)從黃斑中央凹向周圍增加，在距中心凹8°處達(dá)到高峰后，向周邊減少[16]。眼底中央凹自發(fā)熒光少的主要原因黃斑色素對(duì)激發(fā)光的吸收和RPE中心有高密度的黑色素。脂褐素顆粒中熒光團(tuán)的組成可隨年齡或病理改變而變化，進(jìn)而可導(dǎo)致眼底自發(fā)熒光光譜特征的改變[17-18]。事實(shí)上，眼底自發(fā)熒光的光譜光度測(cè)量表明，65歲時(shí)的熒光比25歲時(shí)的熒光強(qiáng)2.8倍，但自發(fā)熒光在70歲以后會(huì)下降，可能是由于RPE細(xì)胞隨年齡減少，另一個(gè)促成因素可能是A2E光氧化相關(guān)的熒光下降。由于RPE脂褐素的自發(fā)熒光色素是由全反式視黃醛產(chǎn)生的，所以當(dāng)11順式和全反式視黃醛發(fā)色團(tuán)不能通過(guò)視循壞產(chǎn)生時(shí)，比如在與RPE65突變相關(guān)的早發(fā)性視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良中，將不存在眼底自發(fā)熒光[19-20]。此外，通過(guò)眼底熒光成像對(duì)RPE脂褐素的體內(nèi)監(jiān)測(cè)已經(jīng)證明，RPE顯示出強(qiáng)烈自發(fā)熒光的區(qū)域容易萎縮，自發(fā)熒光增加的病灶區(qū)域是進(jìn)展為ARMD的危險(xiǎn)因素。眼底自發(fā)熒光激發(fā)光譜在490～510nm(體內(nèi))和590～630nm(體外)達(dá)到峰值[21]，RPE脂褐素激發(fā)光譜在590～600nm達(dá)到峰值[22]。眼底自體熒光的光譜特征與RPE脂褐素的光譜特征一致，當(dāng)被逐漸變長(zhǎng)的波長(zhǎng)激發(fā)時(shí)，整個(gè)脂褐素記錄的發(fā)射光譜顯示出紅移[23]。有研究表明脂A2E在眼底自發(fā)總熒光強(qiáng)度中并不占優(yōu)勢(shì)，A2E的氧化形式比A2E本身具有更強(qiáng)的熒光，A2E對(duì)眼底自發(fā)總熒光強(qiáng)度的貢獻(xiàn)不大[18,23]。Tatiana等發(fā)現(xiàn)在不同激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)下，A2E和iso-A2E的熒光強(qiáng)度明顯低于其他熒光團(tuán)[18]。

3 RPE脂褐素引起ARMD的可能機(jī)制

3.1 RPE脂褐素對(duì)細(xì)胞的影響在體內(nèi)，局部脂褐素含量與鄰近感光細(xì)胞的損傷直接相關(guān)，表現(xiàn)出對(duì)RPE細(xì)胞的毒性[24]。超過(guò)一定濃度的A2E或脂褐素能破壞RPE的細(xì)胞膜、從線粒體分離促凋亡蛋白、損害溶酶體功能(抑制溶酶體質(zhì)子泵、堿化溶酶體并增加溶酶體內(nèi)膽固醇含量而抑制吞噬功能)等，造成RPE損傷[25]，這些可能與A2E的特殊結(jié)構(gòu)有關(guān)，A2E的兩親性結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其能聚集、誘導(dǎo)洗滌劑樣膜完整性喪失、溶解單層膜的脂質(zhì)雙層并引發(fā)膜泡起泡。而Cheng等[26]發(fā)現(xiàn)A2E在破壞線粒體膜方面特有效，可能是由于帶負(fù)電荷的線粒體膜和帶正電荷的A2E分子之間有很好的相互作用。Wang等[27]認(rèn)為A2E的光氧化會(huì)引起DNA損傷，包括端粒去保護(hù)作用，進(jìn)一步加速RPE細(xì)胞的衰老，并導(dǎo)致旁分泌效應(yīng)，影響整個(gè)視網(wǎng)膜環(huán)境，從而可能導(dǎo)致視網(wǎng)膜變性。脂褐素還被證明可與氧化還原活性的金屬比如鐵結(jié)合，產(chǎn)生活性氧，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，脂褐素導(dǎo)致細(xì)胞損傷和細(xì)胞毒性的程度似乎與脂褐素本身存在的鐵濃度密切相關(guān)[11,28]。Parmar等[29]利用誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來(lái)源的RPE細(xì)胞與10μmol/L的A2E共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)與時(shí)間成正比的細(xì)胞死亡數(shù)的增多，并出現(xiàn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子上調(diào)和26種前體炎性因子上調(diào)，促進(jìn)脈絡(luò)膜新生血管的形成，引起視網(wǎng)膜炎癥，導(dǎo)致RPE細(xì)胞損傷。一些研究表明，A2E本身并不會(huì)引起RPE細(xì)胞死亡，反而可刺激RPE細(xì)胞自噬，防止損傷細(xì)胞的積累[30-31]，自噬在保護(hù)RPE免受氧化應(yīng)激和脂褐素積累中起著重要作用，但當(dāng)自噬能力隨著脂褐素積累的增加而下降時(shí)，可加速ROS生成和蛋白聚集，激活炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步誘發(fā)RPE長(zhǎng)期的炎癥、加速老化過(guò)程、細(xì)胞變性，最終可導(dǎo)致細(xì)胞死亡[32]。脂褐素還有一個(gè)重要特征是它能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合蛋白水解酶抑制氧化蛋白降解，包括20S蛋白酶體和溶酶體蛋白酶，導(dǎo)致脂褐素的進(jìn)一步積累，增強(qiáng)它的細(xì)胞毒性[6]。

3.2 RPE脂褐素的光氧化隨著年齡的增長(zhǎng)，RPE細(xì)胞中光氧化和光降解產(chǎn)物水平的增加尤其可能增加ARMD的風(fēng)險(xiǎn)。Zareba等[33]發(fā)現(xiàn)原代培養(yǎng)人RPE細(xì)胞的光損傷程度與其內(nèi)源性脂褐素含量成正比。Kim等在分離的人和小鼠視網(wǎng)膜色素上皮中檢測(cè)到A2E和全反式視黃醛二聚體的光氧化形式，提出光氧化在眼睛中是一個(gè)持續(xù)的過(guò)程[24]。對(duì)RPE脂褐素和單個(gè)脂褐素?zé)晒鈭F(tuán)(如全反式視黃醛二聚體和A2E)的研究表明，這些化合物是單線態(tài)氧和超氧化物陰離子等活性氧的光誘導(dǎo)發(fā)生器[34-35]。用藍(lán)光對(duì)人RPE分離的脂褐素顆粒進(jìn)行有氧光活化，可產(chǎn)生單線態(tài)氧、超氧陰離子和過(guò)氧化氫等大量氧自由基[36]，引發(fā)細(xì)胞膜功能異常、溶酶體和抗氧化酶失活，尤其是A2E在藍(lán)光激發(fā)下形成有害的A2E-環(huán)氧化物能加速活性氧產(chǎn)生，引發(fā)RPE細(xì)胞損傷[34]。RPE脂褐素的光毒性在體外研究中也得到證實(shí)，在人RPE細(xì)胞培養(yǎng)基中預(yù)載脂褐素顆粒，暴露于390～550nm光下，脂褐素光敏細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的形態(tài)學(xué)改變，溶酶體完整性喪失，脂質(zhì)過(guò)氧化增強(qiáng)，存活率顯著降低[37]。Magdalena等首次證實(shí)人RPE脂褐素顆粒誘導(dǎo)的光氧化會(huì)損傷RPE細(xì)胞的特異性吞噬活性，抗氧化劑具有中和脂褐素產(chǎn)生活性氧的作用[38]，證實(shí)了活性氧以及氧化應(yīng)激在ARMD發(fā)生過(guò)程中的重要性。

A2E和全反式視黃醛二聚體光氧化后能刺激補(bǔ)體激活[39]，還可導(dǎo)致Abca4突變小鼠的Bruch膜增厚和光感受器細(xì)胞變性[40]。Yamamoto等[41]觀察到靈長(zhǎng)類動(dòng)物體內(nèi)RPE脂褐素?zé)晒庀陆担@可能是由于脂褐素有光氧化和光降解的傾向。在任何給定時(shí)間，眼底自發(fā)熒光的強(qiáng)度可能是熒光團(tuán)合成與RPE中脂褐素光氧化/光降解不同步的結(jié)果。在視網(wǎng)膜血管的陰影下，由視黃醛(11-順式轉(zhuǎn)換為全反式視黃醛)形成的脂褐素可繼續(xù)有增無(wú)減，但脂褐素光氧化將顯著減少[14,42]，因此視網(wǎng)膜易位比如視網(wǎng)膜脫離時(shí)會(huì)顯示出更強(qiáng)烈的自體熒光的血管印記。

3.3其他脂褐素色素的積累是正常RPE的特征，但是在Abca4基因突變相關(guān)的視網(wǎng)膜疾病(比如隱性Stargardt病)中特別豐富，20～29歲的Stargardt患者的自發(fā)熒光強(qiáng)度甚至比60～69歲的正常人高2倍，Abca4中某些突變的致病雜合體也表現(xiàn)出對(duì)ARMD的易感性增加[43]。RPE脂褐素的光氧化產(chǎn)物還可激活補(bǔ)體，引起慢性炎癥過(guò)程，逐漸使黃斑患病，因此補(bǔ)體激活未被充分調(diào)節(jié)也被認(rèn)為是與ARMD易感性的基礎(chǔ)[44]。此外，視網(wǎng)膜下小膠質(zhì)細(xì)胞中脂褐素隨年齡增加而積累，能促進(jìn)炎癥和補(bǔ)體激活與沉積，進(jìn)而驅(qū)動(dòng)ARMD病理過(guò)程中視網(wǎng)膜外免疫失調(diào)[45]。載脂蛋白B隨年齡增長(zhǎng)沉積在Bruch膜中形成脂質(zhì)壁，與上述產(chǎn)生的活性氧作用產(chǎn)生炎性過(guò)氧化脂質(zhì)，引發(fā)新生血管，從而參與玻璃膜疣的形成，玻璃膜疣是ARMD特有的富含脂質(zhì)的細(xì)胞外病變。

4小結(jié)

雖然RPE脂褐素是引發(fā)ARMD的主要因素這一觀點(diǎn)尚未得到證實(shí)，但脂褐素參與ARMD病因?qū)W的證據(jù)不容忽視，越來(lái)越多的跡象表明RPE脂褐素過(guò)度積累可導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙，并導(dǎo)致視網(wǎng)膜老化和退化。因此我們應(yīng)努力了解ARMD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中RPE脂褐素所起的作用，以及與其他因素之間的可能聯(lián)系，從而為ARMD的預(yù)防與治療提供巨大幫助。