張 偉 閆越穎 王政潔

(菏澤市立醫(yī)院皮膚科，菏澤274000)

自1936年首次發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素以來，人們?cè)谛l(wèi)矛科雷公藤屬植物雷公藤中已分離得到生物堿、萜類及多糖等有效成份100余種[1,2]。既往研究表明雷公藤具有抗炎及免疫抑制作用，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、器官移植、腫瘤等疾病治療中具有顯著療效[3，4]。近期研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤能夠阻止淋巴細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)活化的淋巴細(xì)胞凋亡，對(duì)T細(xì)胞具有顯著的抑制作用[5，6]，但詳細(xì)機(jī)制不明；樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells，DCs)是調(diào)控免疫系統(tǒng)最強(qiáng)細(xì)胞之一，其成熟后在T細(xì)胞激活過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是機(jī)體激活T細(xì)胞的最重要因素[7]。

雷公藤生物學(xué)成份復(fù)雜，其生理活性成份主要為二萜內(nèi)酯、生物堿、三萜等。其中生物堿包括雷公藤精堿(Wilforgine)、雷公藤新堿(Euonine)、衛(wèi)矛堿(Euonymine)等[8]。雷公藤新堿分子式為C38H47NO18，作為雷公藤重要的活性成分之一，是否具有與雷公藤相似的藥理學(xué)作用及其詳細(xì)作用機(jī)制，有待進(jìn)一步探討。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)與抗體芯片技術(shù)檢測雷公藤新堿對(duì)LPS誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells，DCs)成熟過程中表面分子變化、抗原吞噬能力及細(xì)胞因子分泌的變化，以探明雷公藤新堿對(duì)DCs成熟過程影響的具體作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用雷公藤治療自身免疫性等炎癥相關(guān)疾病找到理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 流式細(xì)胞儀購自BD公司(Aria2，BD,USA)，雌性C57BL/6小鼠購自山東大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，RPMI1640培養(yǎng)基購自Gibco公司，無鈣鎂的Hank′s平衡鹽溶液購自Hyclone公司，rmGM-CSF購自瑞典ProSpec公司(#cyt-720)，rmIL-4購自美國R&D公司(# 404-ML-010)，LPS購自Sigma公司(#L2630)，MHCⅡ、CD80、CD86等流式抗體購自BD公司，抗體芯片購自Abcam公司(#Ab133995)，雷公藤新堿購自南京景竹生物科技有限公司(# 37239-48-8)。

1.2方法

1.2.1小鼠骨髓DCs的獲取 將C57BL/6小鼠頸椎脫位法處死，取出股骨與脛骨浸泡在RPMI1640培養(yǎng)中，用1 ml培養(yǎng)基沖洗骨髓腔中的骨髓，收集骨髓懸液，離心棄上清；加入細(xì)胞沉淀體積3倍量Tris-NH4Cl溶液室溫裂解紅細(xì)胞，離心棄上清，PBS洗滌2～3次；使用RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以細(xì)胞密度2×106ml-1接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中，依次加入 rmIL-4 、mGM-CSF(工作液濃度為10 ng/ml)，37℃、 5%CO2培養(yǎng)48 h，每隔一天半量換新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)5 d，流式細(xì)胞儀檢測樹突狀細(xì)胞純度。

1.2.2DCs成熟過程中MHCⅡ、CD80、CD86分子標(biāo)志檢測 獲取小鼠骨髓DCs后，以6×105ml-1細(xì)胞濃度分別接種于無菌的A、B培養(yǎng)板中；A培養(yǎng)板加入終濃度1 μg/ml LPS，37℃、5%CO2培養(yǎng)48 h；B培養(yǎng)板加入終濃度1 μg/ml LPS與雷公藤新堿(工作濃度為40 ng/ml)混合液，37℃、5%CO2培養(yǎng)48 h；常規(guī)消化細(xì)胞后，向流式管中加入50 μl細(xì)胞懸液與1 μl抗小鼠MHCⅡ、CD80、CD86標(biāo)志的熒光抗體，另取一支流式管加入50 μl細(xì)胞懸液作為空白對(duì)照；輕柔混勻后室溫避光靜置45 min，PBS洗滌2次；流式細(xì)胞術(shù)檢測DCs表面相關(guān)分子表達(dá)量變化。

1.2.3DCs抗原吞噬能力檢測 取上述A、B兩板中約一半細(xì)胞加入濃度為1 mg/ml的FITC-dextran，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105ml-1，800 r/min離心5 min，棄上清后PBS洗2遍，流式細(xì)胞儀檢測DCs吞噬能力變化，同時(shí)以未處理細(xì)胞作為陰性對(duì)照。

1.2.4抗體芯片檢測 收集A、B兩板DCs細(xì)胞培養(yǎng)上清液；取出抗體膜置于反應(yīng)盒中，向反應(yīng)盒中緩慢加入2 ml 1×封閉液，室溫孵育30 min；棄去封閉液，輕輕加入1 ml 樣品液，室溫孵育1～2 h；去除樣品液，依次用2 ml 1×洗液Ⅰ、2 ml 1×洗液Ⅱ，各洗膜3次×5 min；用2 ml 1×封閉液溶解抗體管中的生物素，配成一抗反應(yīng)液備用；向反應(yīng)盒中加入1 ml上述一抗反應(yīng)液，室溫孵育1～2 h；洗掉多余抗體；用1×封閉液稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗鏈酶生物素抗體，向反應(yīng)盒中加入上述稀釋液2 ml，室溫孵育2 h；洗膜；各取ECL試劑盒中A、B液250 μl，混合均勻備用；將反應(yīng)盒中的膜取出，置于保鮮膜上，加入染色液并采集數(shù)據(jù)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本實(shí)驗(yàn)使用Graphpad Prism7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(GraphPad Software，San Diego，CA，USA)。數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)，當(dāng)P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1雷公藤新堿影響LPS誘導(dǎo)DCs成熟過程 加入雷公藤新堿組中DCs表面的協(xié)同刺激分子MHCⅡ、CD80、CD86的表達(dá)量與對(duì)照組相比明顯降低。結(jié)果如圖1所示，MHCⅡ分子實(shí)驗(yàn)組55.3%，對(duì)照組66.7%；CD80實(shí)驗(yàn)組36.4%，對(duì)照組62.4%；CD86實(shí)驗(yàn)組36.5%，對(duì)照組60.2%，每組分別進(jìn)行3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。以上結(jié)果表明雷公藤新堿可降低LPS誘導(dǎo)DCs成熟過程。

2.2雷公藤新堿增強(qiáng) DCs抗原吞噬能力 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，與對(duì)照組相比，雷公藤新堿組吞噬FITC-Dextran的DCs比值增多，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖1 雷公藤新堿降低LPS誘導(dǎo)DCs表面MHCⅡ、CD80、CD86表達(dá)量

圖2 雷公藤新堿增強(qiáng)DCs吞噬能力

表1雷公藤新堿作用后細(xì)胞因子分泌變化

Tab.1Changesofcytokinesecretionaftereuonineadministration

CytokinesFull nameLPS groupLPS+euonine groupP valueIL-13Interleukin 1345.55±3.6038.80±2.990.05IL-15Interleukin 15141.20±12.63115.17±8.900.05IL-1αInterleukin 1 Alpha114.74±7.2072.73±10.230.01IL-1βInterleukin 1 Beta 35.97±3.8016.88±4.550.001IL-2Interleukin 2 115.44±8.73105.02±9.560.08IL-3Interleukin 333.17±4.3235.88±5.100.12IL-4Interleukin 4 27.34±4.3334.72±2.740.08IL-6Interleukin 6 105.13±11.30110.41±14.570.11IL-7Interleukin 7 18.68±2.3011.97±4.390.05IL-8Interleukin 8 135.65±5.00221.63±14.300.01APC-1Antigen Presenting Cells 1990.22±72.89547.50±29.500.01APC-2Antigen Presenting Cells 265.80±10.7424.07±6.980.001M-CSFMacrophage Colony Stimulating Factor160.00±18.00136.50±22.800.01MIP-1αMacrophage Inflammatory Protein 1 Alpha103.80±17.3046.23±5.600.001MIP-1βMacrophage Inflammatory Protein 1 Beta1 054.38±58.601 014.83±78.110.26MIP-1δMacrophage Inflammatory Protein 1 Delta268.17±44.30361.87±26.890.05TGF-β1Transforming Growth Factor Beta 187.83±21.30110.85±37.200.05

圖3 小鼠抗體芯片檢測結(jié)果

2.3雷公藤新堿降低LPS誘導(dǎo)DCs上清中細(xì)胞因子分泌水平 檢測結(jié)果如表1和圖3所示，與對(duì)照組相比，雷公藤新堿實(shí)驗(yàn)組可降低大部分細(xì)胞因子分泌水平，特別是APC-2、MIP-1α及IL-1β的表達(dá)水平較對(duì)照組明顯降低。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

DCs主要有DC1、DC2兩種亞型，其中DC1主要由細(xì)菌LPS、病毒等誘導(dǎo)產(chǎn)生，DC2則主要由IL-1、腫瘤壞死因子(TNF-α)誘導(dǎo)產(chǎn)生[9]。DCs的起源、表型以及亞型的異質(zhì)性與多樣性決定了它復(fù)雜的生物學(xué)特性，體內(nèi)多以不成熟DCs存在，不成熟的DCs具有較強(qiáng)的胞飲、吞噬及受體介導(dǎo)攝取抗原的能力，但幾乎沒有抗原遞呈的能力，且不能激活T淋巴細(xì)胞和免疫應(yīng)答，其表面低表達(dá)共刺激分子、限制性標(biāo)志分子與MHC分子等。當(dāng)不成熟DCs由中樞淋巴器官、初級(jí)淋巴器官向外周、次級(jí)淋巴結(jié)遷移時(shí)，伴隨著DCs形狀、細(xì)胞表面分子數(shù)目及細(xì)胞因子受體形態(tài)的改變，逐漸演變?yōu)槌墒斓腄Cs。成熟的DCs高表達(dá)上述分子，同時(shí)上調(diào)趨化受體，大量分泌IL-1α、IL-1β、IL-8、IL-12等細(xì)胞因子[10]。成熟的DCs具有極強(qiáng)的抗原呈遞能力、可刺激淋巴T細(xì)胞活化增殖，啟動(dòng)免疫應(yīng)答，參與T細(xì)胞介導(dǎo)的特異性免疫應(yīng)答[11]。DCs是唯一能激活初始T細(xì)胞(naive T cell,Tn)的抗原呈遞細(xì)胞，Tn活化以后分化成Th1、Th2、Th7以及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，Th1/Th2動(dòng)態(tài)平衡是維持正常免疫狀態(tài)的關(guān)鍵，Th1/Th2比例失衡將會(huì)誘導(dǎo)炎癥性疾病的發(fā)生，因此DCs可通過該途徑參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程[12]。

本研究發(fā)現(xiàn)小鼠骨髓DCs在加入雷公藤新堿后與單獨(dú)LPS誘導(dǎo)組相比，其表面分子MHCⅡ、CD80、CD86均明顯降低。LPS作為抗原成份刺激DCs成熟，使其共刺激分子、表面分子表達(dá)上調(diào)，從而有效激活T細(xì)胞誘導(dǎo)免疫應(yīng)答[13]。以上結(jié)果表明雷公藤新堿能夠抑制DCs成熟，隨后我們又對(duì)DCs進(jìn)行了抗原吞噬能力檢測，同樣發(fā)現(xiàn)雷公藤新堿干預(yù)后，DCs吞噬能力比未干預(yù)組顯著增強(qiáng)，該結(jié)果進(jìn)一步表明雷公藤新堿可抑制LPS誘導(dǎo)DCs成熟作用，提示雷公藤可能通過抑制DCs成熟進(jìn)而抑制T細(xì)胞參與機(jī)體免疫應(yīng)答過程。

同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)利用抗體芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)雷公藤新堿干預(yù)組與對(duì)照組相比，IL-4、IL-8、MIP-1δ等細(xì)胞因子表現(xiàn)為細(xì)微上調(diào)現(xiàn)象，其他因子相對(duì)于對(duì)照組表達(dá)水平均有所下降。DCs細(xì)胞成熟一般需要共刺激分子的表達(dá)及細(xì)胞因子表達(dá)的上調(diào)[14]，LPS則主要通過與TLR4受體結(jié)合促進(jìn)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。本研究中雷公藤新堿調(diào)控大部分TLR4通路細(xì)胞因子表達(dá)下調(diào)，表明雷公藤新堿可能通過TLR4信號(hào)通路調(diào)控DCs成熟過程，但詳細(xì)機(jī)制需進(jìn)一步進(jìn)行研究。與對(duì)照組相比APC-2、MIP-1α及IL-1β減少量尤為明顯，APC-2、MIP-1α及IL-1β等細(xì)胞因子主要激活CD4+Th1細(xì)胞亞群，導(dǎo)致炎癥的產(chǎn)生；而IL-4、IL-8、MIP-1δ等細(xì)胞因子主要激活CD4+Th2細(xì)胞亞群從而抑制炎癥。因此，我們的結(jié)果進(jìn)一步表明雷公藤新堿影響DCs的成熟過程，也提示雷公藤新堿具有有效地抗炎作用。

DCs具有極強(qiáng)的抗原提呈能力，在免疫應(yīng)答及免疫耐受中具有重要的作用。相信隨著研究的不斷深入，DCs終將成為治療皮膚病等各種炎癥性疾病、自身免疫病等疾病的重要作用靶點(diǎn)。雷公藤是臨床應(yīng)用中非常重要的免疫抑制藥物，對(duì)免疫調(diào)節(jié)具有明顯的抑制作用及抗炎作用，已在臨床應(yīng)用取得了可喜的成果。但雷公藤成分復(fù)雜，免疫調(diào)控機(jī)制尚不明確以及毒副作用較強(qiáng)，在如何取得單一有效的成分、降低毒副作用的發(fā)生等領(lǐng)域仍存在許多值得深入探討的問題。本研究發(fā)現(xiàn)雷公藤新堿作為雷公藤的重要組成分之一，可以有效抑制DCs的成熟過程，提示可能在DCs及T細(xì)胞參與的免疫性疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用，因此，本研究具有十分重要的理論與實(shí)踐意義。