張哲 方毅 舒亦斌 涂金明 吳綿勇 黃小剛

食管賁門失弛緩癥為食管肌肉功能障礙性疾病，其主要特征是食管缺乏蠕動，食管下括約肌高壓和對吞咽動作的松弛反應(yīng)障礙。主要發(fā)生在食管下段，本病是一種少見病，其發(fā)病率國外報(bào)道約0.5～1/10萬，占食管疾病的2%～20%。其病因至今尚未完全明確，可能與精神因素、自身免疫、病毒感染和遺傳因素導(dǎo)致食管肌肉層神經(jīng)節(jié)變性、退化、減少或缺如等有關(guān)［1］。瘦素是肥胖基因編碼的蛋白相關(guān)產(chǎn)物，瘦素受體是一種單跨膜的細(xì)胞受體，研究認(rèn)為瘦素與消化道腫瘤關(guān)系密切，瘦素及受體在結(jié)腸癌、胃癌、食管癌多種腫瘤細(xì)胞中均有表達(dá)，賁門失弛緩癥約2%～7%可發(fā)生癌變［2］。本文探討瘦素及其受體在食管賁門失弛緩中的意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 選擇2012年1月至2017年12月本院食管賁門失弛緩癥患者22例，男6例，女16例；年齡16～68歲，平均年齡60.3歲。均有吞咽困難。內(nèi)鏡檢查食管上段有不同程度的擴(kuò)張，下段有環(huán)形收縮，取賁門處食管組織。后行X線食管鋇劑造影，呈典型鳥嘴癥，均經(jīng)高分辨食管測壓確診。同時(shí)取健康者食管組織30例為對照組，男20例，女10例；年齡28～68歲，平均年齡54.4歲。所有標(biāo)本均常規(guī)脫水，石蠟包埋，4μm連續(xù)切片。所有病例取石蠟切片一張行蘇木素-伊紅（HE）染色。所有入組人員均簽署知情同意書，本項(xiàng)目經(jīng)本院倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 免疫組織化學(xué) Leptin羊抗人多克隆抗體（SC-842）和ob-R羊抗人多克隆抗體（SC-1834）購自Santa Cruze公 司 ；Immunostain SP Kit試 劑 盒 購 自Maxim Biotech，Inc公司，SC-842與SC-1834的工作液濃度為1∶100；二胺基聯(lián)苯氨（DAB）顯色試劑盒購自北京中山生物技術(shù)有限公司。切片常規(guī)進(jìn)行脫蠟、阻斷內(nèi)源性過氧化酶的活性、抗原修復(fù)和封閉，采用鏈霉菌抗生物素蛋白一過氧化物酶（SP法）進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，DAB顯色。

1.3 免疫組化結(jié)果判斷 瘦素表達(dá)陽性為細(xì)胞質(zhì)染成棕黃色顆粒。瘦素受體表達(dá)陽性為細(xì)胞膜染成棕黃色顆粒。按以下方法進(jìn)行半定量分類：組織標(biāo)本未染色（-）；＜25%細(xì)胞染色（+）；25%～50%細(xì)胞染色（++）；50%～75%腫胞染色（+++）；＞75%細(xì)胞染色（++++）。每片選擇4個(gè)不重復(fù)的高倍視野，計(jì)算陽性表達(dá)細(xì)胞占全部細(xì)胞總數(shù)的百分率，取其均值為陽性表達(dá)率。

1.4 圖像分析 采用Imge-pro plus 6.0軟件對每張切片400倍數(shù)隨機(jī)攝像的圖像進(jìn)行分析，取細(xì)胞組織中瘦素及受體染色平均積分吸光度值（IA）表示陽性物質(zhì)相對含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 瘦素和瘦素受體在食管賁門失弛緩及正常食管組織中的表達(dá) 瘦素和瘦素受體在食管賁門失弛緩組織中表達(dá)分別為81.8%、86.4%，正常食管組織中的表達(dá)為53.3%、50.0%。兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1、2。

表1 瘦素在正常食管及賁門失弛緩癥者食管中的表達(dá)（n）

表2 瘦素受體在正常食管及賁門失弛緩癥者食管中的表達(dá)

2.2 賁門失弛緩癥組織中的瘦素及其受體與臨床特征的關(guān)系 瘦素及受體的表達(dá)與性別、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

表3 瘦素和瘦素受體表達(dá)與年齡、性別相關(guān)性［n（%）］

2.3 賁門失弛緩癥與正常食管組織中瘦素及受體的IA值比較 瘦素在賁門失弛緩癥及正常食管組織 中 的 平 均 IA 值 分 別 為 ：（86365.63±25684.24）、（650476.25±15256.52）； 其 受 體 在 賁 門 失 弛緩癥與正常食管組織中的平均IA值分別為（89524.25±18524.25）、（68751.25±11568.25）。 瘦 素及其受體在賁門失弛緩癥與正常食管組織中的平均IA值比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

國內(nèi)外大量研究表明瘦素可以作為促細(xì)胞分裂劑、存活因子、代謝調(diào)節(jié)劑、血管生長因子等而對外周很多器官產(chǎn)生作用［3］，曾有學(xué)者發(fā)現(xiàn)瘦素對胃食管反流病的發(fā)生發(fā)展中起一定作用，國內(nèi)相關(guān)研究［4］亦證實(shí)食管癌瘦素及其受體的表達(dá)率均高于正常的食管黏膜。瘦素及其受體與食管病變關(guān)系密切，賁門失弛緩癥是食管癌的癌前病變之一，其病因尚不明確。

本資料結(jié)果顯示，瘦素及其受體在22例食管賁門失弛緩標(biāo)本中的表達(dá)率分別為81.8%、86.4%；在不同年齡與性別間的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其在正常食管組織中的表達(dá)率分別為53.3%、50.0%。瘦素及其受體在食管賁門失弛緩及正常食管組織的表達(dá)率比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測瘦素及其受體，其在食管賁門失弛緩組織中呈現(xiàn)出雙重高表達(dá)現(xiàn)象，且高于正常人食管組織，賁門失弛緩癥患者因食管蠕動能力下降，食物易潴留，細(xì)菌繁殖及物理刺激，致黏膜糜爛，潰瘍形成，在上皮增生修復(fù)過程中，瘦素作為一種促有絲分裂劑及非特異性的促腫瘤生長因子，促進(jìn)細(xì)胞的生長和繁殖［5-6］，同時(shí)可能促進(jìn)血管及細(xì)胞的異常增生，導(dǎo)致癌變，推測高表達(dá)的瘦素及受體可能直接參與食管賁門失弛緩癥發(fā)生癌變的發(fā)展的過程。圖像分析結(jié)果顯示食管賁門失弛緩癥患者食管組織中瘦素及其受體的平均IOD值明顯高于正常食管組織（P＜0.01），提示食管賁門失弛緩癥食管組織不僅有較高的瘦素及受體表達(dá)率，且表達(dá)含量高于正常食管組織。食管組織中瘦素及其受體異常表達(dá)可能會引起一系列病理生理改變，其中高含量表達(dá)的瘦素就有可能激活某些信號通路導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的變性，最終引起食管肌間神經(jīng)叢抑制性神經(jīng)缺失導(dǎo)致其發(fā)病［7］，瘦素還可以作為有絲分裂劑和細(xì)胞生長因子促進(jìn)食管平滑肌分裂增生，引起食管平滑肌肥厚，導(dǎo)致食管賁門失弛緩癥的形成。瘦素及受體在賁門失弛緩癥及食管癌中均雙重高表達(dá)現(xiàn)象，推測瘦素及其受體在賁門失弛緩癥發(fā)生發(fā)展的過程中可能起重要的作用。

綜上所述，瘦素及其受體在食管賁門失弛緩組織中呈現(xiàn)雙重高表達(dá)現(xiàn)象，提示其與食管失弛緩癥發(fā)生及癌變關(guān)系密切。推測通過檢測瘦素及其受體可以作為早期發(fā)現(xiàn)食管失弛緩癥和監(jiān)測食管失弛緩癥發(fā)生癌變的一種輔助實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，拮抗瘦素及其受體也可能是治療賁門失弛緩癥及預(yù)防賁門失弛緩癥癌變的方式之一。