祝霞，王媛，劉琦，趙丹丹，韓舜愈，楊學(xué)山*

1(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州，730070) 2(甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州，730070)

酒精含量低(1%～7%)且香氣濃郁、酸度適中、口味偏甜、色澤清新的甜型白葡萄酒，不但降低了高酒精度對(duì)人體的危害，同時(shí)富含維生素、黃酮、白藜蘆醇等保健功能成分，深受女性和年輕消費(fèi)者的青睞[1-3]。目前，國(guó)內(nèi)外主要通過(guò)減少可發(fā)酵糖分[3]、脫醇[4]以及采用添加SO2終止發(fā)酵[5]等特殊的發(fā)酵模式生產(chǎn)低醇葡萄酒，在降低酒精度的同時(shí)不可避免的造成了香氣成分損失。

香氣是決定葡萄酒，尤其是白葡萄酒品質(zhì)的關(guān)鍵要素，也是體現(xiàn)不同葡萄酒產(chǎn)品風(fēng)格及特征差異的主要呈現(xiàn)方式[6-7]。在葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中，微生物對(duì)發(fā)酵香氣化合物的產(chǎn)生具有重要影響[8]。早期普遍認(rèn)為非釀酒酵母(non-Saccharomycescerevisiae)菌株對(duì)酒精、SO2等釀酒因子的耐受性不強(qiáng)，不適合葡萄酒發(fā)酵[9]。但近年來(lái)許多研究表明，合理的利用非釀酒酵母發(fā)酵可有效提高葡萄酒香氣品質(zhì)。CONTRERAS等[10]、VARELA等[11-12]釀造葡萄酒時(shí)均發(fā)現(xiàn)，美極梅奇酵母(Metschnikowiapulcherrima)與釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)共同發(fā)酵能明顯提高酒樣中花香及果香味；原苗苗等[13]研究發(fā)現(xiàn)戴爾有孢圓酵母(Torulasporadelbrueckii)與S.cerevisia混合發(fā)酵增加了赤霞珠葡萄酒中香氣化合物種類(lèi)和含量，尤其是乙基酯類(lèi)含量，提升了葡萄酒的香氣和復(fù)雜性。接種扁平云假絲酵母(Candidahumilis)與S.cerevisiae產(chǎn)生較高含量的酯類(lèi)化合物，其中丁酸乙酯的含量提高了3.77倍，促進(jìn)酒樣花果香的形成[14]；申靜云等[15]研究發(fā)現(xiàn)混菌發(fā)酵的威代爾冰葡萄酒顯示了獨(dú)特的風(fēng)味成分和高濃度的發(fā)酵香氣化合物，從而改善了純種釀酒酵母菌株酒精發(fā)酵后香氣單一、風(fēng)味同質(zhì)化的問(wèn)題。但利用非釀酒酵母在發(fā)酵初期接種增殖時(shí)大量消耗糖、產(chǎn)乙醇能力弱、合成香氣化合物豐富的特點(diǎn)，混菌發(fā)酵生產(chǎn)低醇葡萄酒的相關(guān)研究未見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)以甘肅河西走廊產(chǎn)區(qū)貴人香(Italian Riesling)葡萄為原料，分別選用M.apulcherrima、T.delbrueckii與S.cerevisia進(jìn)行順序接種，篩選產(chǎn)香性能較優(yōu)的發(fā)酵組合，并通過(guò)微釀實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證混菌發(fā)酵對(duì)低醇葡萄酒香氣品質(zhì)的影響，以期為開(kāi)發(fā)新型高品質(zhì)、多類(lèi)型的低醇葡萄酒提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

貴人香葡萄采自甘肅莫高實(shí)業(yè)發(fā)展股份有限公司黃羊鎮(zhèn)葡萄種植基地，含糖量約為21.0 Brix%，可滴定酸(以酒石酸計(jì))5.65 g/L，pH 3.37。

釀酒酵母Aroma White，意大利Enartis公司；Mstschnikowiapulcherrima346，法國(guó)Lallemand公司；Torulasporadelbrueckii，丹麥Christian D.A. Hansen公司。

α-萜品醇、β-香茅醇、香葉醇、里那醇、(Z)-橙花叔醇、里那醇、2-辛醇、β-大馬士酮、己酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸乙酯、己酸甲酯、癸酸乙酯、戊醇、己醇、辛酸、橙花醇、苯乙醇、金合歡醇等香氣標(biāo)準(zhǔn)品(色譜純)，美國(guó)Sigma公司；果膠酶(EX-V)，法國(guó)Lallemand公司；偏重亞硫酸鈉、NaCl等其他常規(guī)試劑，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；

1.2 儀器與設(shè)備

TRACE1310氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、ISQ型單四級(jí)桿質(zhì)譜儀，美國(guó)Thermo Scientific公司；色譜柱DB-WAX(60 m×2.5 mm×0.25 μm)，美國(guó)Agilent Technologies公司；固相微萃取(SPME)裝置、50/30 μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅萃取頭，美國(guó)Surpelco公司；錯(cuò)流過(guò)濾機(jī)(中空纖維膜柱，0.2 μm，6-10 L/h)，北京德潤(rùn)鑫鼎工程技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株活化

非釀酒酵母菌株活化：將M.pulcherrima、T.delbrueckii活性干粉分別溶于10倍體積的ddH2O中，28 ℃ 恒溫水浴活化10 min；再加入等體積貴人香葡萄汁，23 ℃恒溫水浴活化10 min。

釀酒酵母菌株活化：將釀酒酵母菌株干粉溶于10倍體積的ddH2O中，28 ℃恒溫水浴活化10 min；再加入等體積的非釀酒酵母菌株貴人香葡萄發(fā)酵液(對(duì)照組加貴人香葡萄汁)，23 ℃恒溫水浴活化10 min。

1.3.2 混菌發(fā)酵接種方式

依據(jù)參考文獻(xiàn)[10-14]和預(yù)實(shí)驗(yàn)香氣測(cè)定結(jié)果，選擇采用先接種非釀酒酵母菌株，后接種釀酒酵母菌株的順序接種方式進(jìn)行低醇白葡萄酒釀造，具體處理見(jiàn)表1。

表1 接種處理方式 單位：mg/LTable 1 Inoculation treatment

注：A組：先接種M.pulcherrima發(fā)酵至酒精度為3.5%時(shí)再接種S.cerevisia進(jìn)行混合發(fā)酵；B組：先接種T.delbrueckii發(fā)酵至酒精度為3.5%時(shí)再接種S.cerevisia進(jìn)行混合發(fā)酵；C組：?jiǎn)为?dú)接種S.cerevisia發(fā)酵，以該組為對(duì)照。

1.3.3 釀造工藝

貴人香葡萄→除梗破碎、過(guò)濾澄清(添加40 mg/L SO2、20 mg/L果膠酶)→貴人香葡萄清汁→接種酵母(處理A、B、C)→23 ℃恒溫發(fā)酵至酒精度為6.5%→0 ℃恒溫靜置3d→取澄清液進(jìn)行錯(cuò)流過(guò)濾→灌裝

得到貴人香低醇甜型白葡萄酒分別取10 mL A、B、C處理發(fā)酵后的樣品于15 mL離心管中，密封保存于-80 ℃以備測(cè)揮發(fā)性香氣化合物，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 香氣成分分析

1.3.4.1 香氣成分的提取

參照本實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化的頂空固相微萃取方法。取8 mL待測(cè)酒樣于15 mL頂空瓶中，加入2.4 g NaCl和10 μL 4-甲基2-戊醇(2 004 mg/L)，加磁力攪拌轉(zhuǎn)子，密封并搖勻，置于恒溫磁力攪拌器中，40 ℃下水浴平衡30 min后頂空萃取30 min。

1.3.4.2 GC-MS條件

采用本實(shí)驗(yàn)室建立的方法。毛細(xì)管色譜柱為DB-WAX(60 m×2.5 mm×0.25 μm)；升溫程序：50 ℃保持5 min，以3.0 ℃/min升溫至200 ℃，保持15 min，進(jìn)樣口溫度 240 ℃，高純氦氣(He)流速1 mL/min，不分流進(jìn)樣。質(zhì)譜接口溫度280 ℃，電子轟擊離子源(EI)，離子源能量70eV，質(zhì)譜掃描范圍20～350m/z。

1.3.4.3 定性與定量

參照原苗苗等[13]、申靜云等[15]的方法，在質(zhì)譜全離子掃描模式下，采用保留指數(shù)(RI)和NIST-11、Wiley及香精香料譜庫(kù)檢索比對(duì)進(jìn)行定性分析。對(duì)萜烯類(lèi)、高級(jí)醇和酯類(lèi)中已有標(biāo)準(zhǔn)品的化合物，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(R2>0.995)定量，無(wú)標(biāo)準(zhǔn)品的化合物采用化學(xué)結(jié)構(gòu)、官能團(tuán)相似、碳原子數(shù)相近的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行半定量。

1.3.5 成品酒樣理化指標(biāo)測(cè)定

總酸、揮發(fā)酸、殘?zhí)?、酒精度、總酚等基本理化指?biāo)參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》進(jìn)行[1]。

1.3.6 成品酒樣感官分析

感官品評(píng)實(shí)驗(yàn)由9名經(jīng)過(guò)葡萄酒品嘗培訓(xùn)的專(zhuān)業(yè)人員進(jìn)行3輪盲品。參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》及VARELA等[11]的方法，對(duì)各酒樣進(jìn)行隨機(jī)編號(hào)，分別從外觀、香氣和風(fēng)味等方面具體評(píng)價(jià)(表2)。評(píng)價(jià)結(jié)果使用7分結(jié)構(gòu)化數(shù)值尺度來(lái)量化，0～7分表示強(qiáng)烈程度逐漸增大。

表2 貴人香低醇白葡萄酒感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Criteria for sensory evaluation of Italian Riesling low alcohol sweet white wine

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用Microsoft Office Excel 2013對(duì)樣本(n=3)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行基本處理，IBM SPSS Statistics 19.0分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 混菌發(fā)酵酒樣香氣成分GC-MS分析

不同酵母菌株組合(A、B、C)發(fā)酵酒樣中檢測(cè)出的揮發(fā)性香氣化合物種類(lèi)及含量見(jiàn)表3。

3組酒樣共檢出105種揮發(fā)性香氣化合物，包括44種酯類(lèi)(約占香氣總量的67.81%～41.05%)、18種醇類(lèi)(42.03%～17.42%)、14種有機(jī)酸類(lèi)(24.64%～12.85%)、13種萜烯類(lèi)(1.07%～0.50%)及16種其他物質(zhì)(2.55%～1.11%)，但各發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組中檢測(cè)到香氣化合物及含量差異較大。

2.1.1 酯類(lèi)化合物

大多數(shù)酯類(lèi)可以賦予葡萄酒濃郁的花香和果香氣味，增加酒體的香氣復(fù)雜性和典型性[16]。

表3 混菌發(fā)酵貴人香酒樣中揮發(fā)性香氣化合物的GC-MS分析Table 3 GC-MS analysis of volatile compounds in Italian Riesling wine by co-fermentation

續(xù)表3

編號(hào)中文名保留指數(shù)(RI)A組B組C組含量/(μg·L-1)OAV含量/(μg·L-1)OAV含量/(μg·L-1)OAV閾值/(μg·L-1)香氣描述A28肉豆蔻酸乙酯2 055.009.59±0.90nd5.63±0.52nd0.59±0.08nd2 000.00椰子、蜂蠟香A29甲酸-2-苯乙酯 dnd0.28±0.01ndndnd\A30己酸-2-苯乙酯 dndndnd0.45±0.17nd\A31辛酸-2-苯乙酯3.67±0.10nd4.07±0.11ndndnd\A32乙酸苯甲酯4.96±0.10nd4.45±0.94ndndnd\A33乙酸苯乙酯1 840225.24±19.990.90860.35±33.343.4423.09±4.460.09250.00花果香,蜜糖味,含羞草香A34苯乙酸乙酯 dndndnd0.18±0.03nd\A35丁酸苯乙酯6.94±2.00nd2.91±0.01ndndnd\A36棕櫚酸乙酯2 248.0021.71±1.000.0116.53±4.160.010.76±0.05nd1 500.00花香,香蕉,梨香A372-己烯酸乙酯1 245.00ndnd6.46±0.01nd0.39±0.06nd\A383-壬烯酸乙酯 dnd1.70±0.00ndndnd\A398-壬烯酸乙酯1.32±0.01nd1.01±0.00ndndnd\A404-癸烯酸乙酯 dndndnd21.34±6.21nd\A419-癸烯酸乙酯1 697.00392.29±21.003.92465.59±39.094.6621.46±0.010.21100.00溫柏果香A426-壬烯-1-醇乙酸酯2.28±0.34nd2.39±0.01ndndnd\A43十一碳烯酸乙酯5.21±0.39nd3.47±0.04ndndnd\A443,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇甲酸酯3.41±0.17nd1.41±0.45ndndnd\共計(jì)3 883.468 155.50297.28B1戊醇1 2561 682.19±30.000.031 270.37±95.290.02123.45±4.53nd64 000.00雜醇味,面包香B2己醇1 358205.62±19.910.03186.86±18.990.024.05±0.08nd8 000.00果香,青香B3辛醇1 40019.33±1.000.4817.34±0.490.432.60±0.180.0640.00茉莉、檸檬味B4癸醇1 7655.79±0.950.013.34±0.010.010.58±0.00nd400.00橙花香B5壬醇1 658.003.60±0.080.728.48±0.201.700.87±0.090.175.00果香、薔薇香B6異丁醇1 100.0024.44±0.460.46nd21.03±0.00nd1.63±0.25nd40 000.00溶劑味,生青味B71-辛烯-3-醇1 447.00ndnd2.74±0.01ndndnd蘑菇香B82-癸烯-1-醇 dnd9.82±1.00ndndnd\B93-壬烯-1-醇 dndndnd0.76±0.16nd\B106-壬烯-1-醇1 715.006.98±0.08nd3.64±0.01nd0.77±0.12nd\B119-癸烯-1-醇 dnd3.97±0.03nd0.42±0.01nd\B12十一烯醇 dnd3.53±0.00ndndnd\B13月桂醇 dndndnd0.39±0.00nd\B14肉豆蔻醇