馬春濤 許春芳 張海玲

蘇州市相城人民醫(yī)院消化內(nèi)科1(215131) 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科2 宿遷市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科3

背景：結(jié)直腸癌(CRC)是常見的癌癥之一，是具有多種生物學(xué)發(fā)病機(jī)制的異質(zhì)性疾病實體。目的：探討錯配修復(fù)蛋白(MMRP)和Ki-67蛋白在CRC中的表達(dá)，分析微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)、Ki-67與CRC臨床病理特征的關(guān)系。方法：回顧性分析2014年1月—2016年12月蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院收治的90例CRC患者的臨床病理資料，采用免疫組化法檢測4種MMRP(MLH1、PMS2、MSH2、MSH6)和Ki-67蛋白表達(dá)，并分析MSI、Ki-67與CRC患者臨床病理特征的關(guān)系以及MSI與Ki-67表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果：MMRP表達(dá)缺失率為16.7%，其中MLH1、PMS2、MSH2和MSH6的表達(dá)缺失率分別為11.1%、11.1%、6.7%、4.4%。Ki-67陽性率為90.0%。MSI與腫瘤部位有關(guān)(P<0.05)，Ki-67表達(dá)與腫瘤部位和大體類型有關(guān)(P<0.05)。MSI與Ki-67表達(dá)無關(guān)(P>0.05)，MLH1與PMS2表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.577，P<0.05)，MSH2表達(dá)與MSH6表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.739，P<0.05)。結(jié)論：CRC中MLH1、PMS2表達(dá)缺失較MSH2和MSH6多見。MSI與腫瘤部位相關(guān)，Ki-67與腫瘤部位和大體類型有關(guān)，對CRC的診療和預(yù)后具有一定的指導(dǎo)意義。但MSI與Ki-67表達(dá)無關(guān)，兩者聯(lián)合檢測并不能提高診斷CRC的準(zhǔn)確性。

結(jié)直腸癌(CRC)是嚴(yán)重威脅人類健康的常見惡性腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)發(fā)病率居惡性腫瘤第三位，據(jù)估計全球每年約有140萬CRC新發(fā)病例[1]。近年我國CRC的發(fā)病率呈明顯上升趨勢，死亡率居所有癌癥的第五位。CRC可能由結(jié)腸黏膜細(xì)胞大量癌基因、抑癌基因、錯配修復(fù)基因以及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因的表觀遺傳學(xué)和基因改變而導(dǎo)致[2]，其主要的致病途徑包括染色體不穩(wěn)定性(CIN)、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)和CpG島甲基化(CIMP)，表觀遺傳學(xué)改變包括DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA的改變[3]。

MSI是由錯配修復(fù)蛋白(MMRP)(包括MLH1、PMS2、MSH2、MSH6)失活導(dǎo)致基因突變而產(chǎn)生[4]。MMRP是一種核酶，參與修復(fù)增殖細(xì)胞DNA復(fù)制產(chǎn)生的錯配堿基，其缺失將導(dǎo)致DNA錯配積聚，導(dǎo)致MSI[5-6]。MMRP與細(xì)胞生長、分化、凋亡有關(guān)的基因突變有關(guān)，若在DNA合成過程中丟失保真度將影響CRC的發(fā)生、發(fā)展[7]。

Ki-67是一個反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的指標(biāo)，在靜止的細(xì)胞中無表達(dá)，在細(xì)胞周期M期、G1后期、G2期和S期均有表達(dá)，與細(xì)胞增殖活性以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)[8]。

本研究通過探討MMRP、Ki-67在CRC中的表達(dá)及其與臨床病理的關(guān)系，并分析MMRP與Ki-67的相關(guān)性，旨在分析MSI、Ki-67與腫瘤發(fā)生、發(fā)展之間的關(guān)系。

對象與方法

一、資料來源

收集2014年1月—2016年12月至蘇州大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院行手術(shù)治療的CRC切除標(biāo)本90例，其中男性57例，女性33例，男女之比為1.73∶1；年齡28～86歲，平均(62.5±2.1)歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：家族性腺瘤性息肉?。环窃l(fā)性CRC；放化療后復(fù)發(fā)性CRC；術(shù)后病理檢查證實為非結(jié)直腸癌。所有病例均具有完整的臨床信息，且患者術(shù)前均未接受過放化療。

二、研究方法

所有患者的標(biāo)本經(jīng)4%甲醛溶液固定，石蠟包埋后存檔。應(yīng)用免疫組化法檢測腫瘤組織中MLH1、MSH2、MSH6、PMS2和Ki-67表達(dá)，具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。鼠抗人單克隆抗體MLH1(工作濃度1∶500)、鼠抗人單克隆抗體PMS2(工作濃度1∶500)、鼠抗人單克隆抗體MSH2(工作濃度1∶500)、鼠抗人單克隆抗體MSH6(工作濃度1∶500)和即用型鼠抗人單克隆抗體Ki-67均購自羅氏公司。

結(jié)果判斷：MLH1、PMS2、MSH2、MSH6均定位于細(xì)胞核，呈黃色或棕黃色顆粒為陽性表達(dá)，腫瘤細(xì)胞核不著色判定為缺失。MLH1、PMS2、MSH2、MSH6蛋白中任意一種缺失判定為MSI，四種蛋白均表達(dá)為微衛(wèi)星穩(wěn)定(MSS)。Ki-67定位于細(xì)胞核，呈棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，按陽性細(xì)胞比例數(shù)分為：(-)，≤10%；(+)，11%～25%；(++)，25%～50%；(+++)，≥50%，(-)歸為Ki-67陰性表達(dá)組，(+)、(++)、(+++)歸為陽性表達(dá)組。每例標(biāo)本均經(jīng)兩位資深病理醫(yī)師復(fù)診。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用GraphPad Prism 6統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、MMRP、Ki-67在CRC中的表達(dá)

90例CRC中MMRP陽性者75例(83.3%)，表達(dá)缺失者15例(16.7%)，其中MLH1、PMS2、MSH2、MSH6表達(dá)缺失者分別為10例(11.1%)、10例(11.1%)、6例(6.7%)和4例(4.4%)，MLH1和PMS2共同表達(dá)缺失者9例(10.0%)，MSH2和MSH6共同表達(dá)缺失者4例(4.4%)，4種蛋白表達(dá)均缺失者1例(1.1%)。Ki-67陰性表達(dá)者9例(10.0%)，陽性表達(dá)者81例(90.0%)(圖1)。

二、MSI、Ki-67表達(dá)與CRC臨床病理特征的關(guān)系

A：Ki-67(×100)；B：MLH1(×400)；C：PMS2(×400)；D：MSH2(×400)；E：MSH6(×400)

MSI與腫瘤部位有關(guān)(P<0.05)，而與患者性別、年齡、腫瘤直徑、大體分型、組織學(xué)類型、分化程度、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、脈管浸潤等均無關(guān)(P>0.05)(表1)。

Ki-67表達(dá)與腫瘤部位、大體分型有關(guān)(P<0.05)，而與患者性別、年齡、腫瘤直徑、組織學(xué)類型、分化程度、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、脈管浸潤等均無關(guān)(P>0.05)(表1)。

三、MSI與Ki-67的相關(guān)性分析

MSI與Ki-67表達(dá)無相關(guān)性(r=-0.149，P=0.161)，MLH1表達(dá)與PMS2表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.577，P<0.05)，MSH2表達(dá)與MSH6表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.739，P<0.05)。

表1 MSI和Ki-67表達(dá)與CRC患者臨床病理特征的關(guān)系(n)

討 論

CRC的發(fā)生、發(fā)展是一個受多基因、多步驟調(diào)控的復(fù)雜過程，約15%的CRC伴有DNA錯配修復(fù)缺陷和高水平MSI[9]。MSI可能對CRC的預(yù)后評估和治療分層具有一定的指導(dǎo)意義。

本研究顯示，MLH1-PMS2、MSH2-MSH6的共同缺失率分別為10.0%、4.4%，且MLH1與PMS2、MSH2與MSH6均呈正相關(guān)(r=0.577，r=0.739)，提示MLH1與PMS2、MSH2與MSH6常協(xié)同表達(dá)或缺失，這可能與DNA在損傷修復(fù)過程中MLH1和MSH2分別與其同源性MMRP形成復(fù)合體發(fā)揮作用機(jī)制相關(guān)。國外研究顯示，MMRP缺失的CRC患者可伴有一系列臨床病理特征，如腫瘤常見于結(jié)腸近端、腫瘤分期為Ⅱ期、分化差以及黏液腺癌[10-11]。本研究顯示，腫瘤位于右半結(jié)腸者的MMRP表達(dá)缺失率更高，但MSI與性別、年齡、腫瘤分期、腫瘤分化、病理分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征無相關(guān)性。

Ki-67是應(yīng)用最廣泛的判斷腫瘤細(xì)胞增殖活性的指標(biāo)之一，與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。Ki-67表達(dá)與CRC臨床病理特征之間的關(guān)系目前尚無定論。Forones等[12]的研究表明Ki-67與CRC臨床病理指標(biāo)無關(guān)，評估患者預(yù)后的價值有限。Sen等[13]認(rèn)為Ki-67表達(dá)與CRC分化程度、分期有關(guān)，腫瘤細(xì)胞分化程度越低、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的Ki-67表達(dá)水平越高。本研究中，CRC患者的Ki-67陽性率為90.0%，且與腫瘤部位、大體分型有關(guān)，即在左半結(jié)腸腫瘤、潰瘍型和隆起型的腫瘤中具有較高的表達(dá)，提示Ki-67在CRC的增生程度、預(yù)后評估中均有一定的意義。關(guān)于Ki-67在CRC中研究結(jié)果的不同可能是由于樣本數(shù)量、地域種族、非標(biāo)準(zhǔn)化操作等所致。

本研究還發(fā)現(xiàn)，MSI與Ki-67表達(dá)無相關(guān)性(P>0.05)，提示MMRP和Ki-67聯(lián)合檢測可能并不能提高對CRC診療和預(yù)后評估的準(zhǔn)確性。但通過檢測MMRP和Ki-67可更好地了解我國CRC的特點，對CRC的早期診斷、風(fēng)險評估、預(yù)后評估具有一定的參考意義，需要今后增大樣本量并行隨訪來進(jìn)一步證實。