楊桂濤，鄺莉雯，劉子健，陳銘俊，何銀茹，曾消凝，張秀楠，高中華

(汕頭大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，廣東 汕頭 515041)

酸奶是牛奶經(jīng)巴氏消毒后，加入乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵，再冷卻灌裝得到的發(fā)酵產(chǎn)品，酸奶中蛋白質(zhì)、碳水化合物和鈣更易被人體消化吸收，具有增強(qiáng)消化、促進(jìn)腸蠕動、增進(jìn)機(jī)體物質(zhì)代謝、預(yù)防腸道疾病、防癌和抗衰老等作用[1-2]。

酸奶中含有大量對人體有益的乳酸菌，當(dāng)乳酸菌活菌體達(dá)到一定數(shù)量時(shí)，才有可能達(dá)到并定植在人體腸道內(nèi)，抑制有害菌的增殖和活動，維持腸道的微生態(tài)平衡，進(jìn)而增進(jìn)人體健康。根據(jù)《GB19302——2010 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵乳》規(guī)定，酸奶中活菌的含量應(yīng)達(dá)到1×106mL-1以上。酸奶的飲用效果不僅受酸奶中活菌含量影響，還與其飲用方式(空飽腹、飲用溫度、飲用時(shí)段)有關(guān)[3]。為探究酸奶的最佳飲用方式，提高人們對酸奶飲用的正確認(rèn)識，本研究通過模擬胃內(nèi)環(huán)境，對不同pH值、溫度下酸奶中乳酸菌的存活率展開研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 酸奶

隨機(jī)抽取汕頭市市售酸奶(100 mL裝)2瓶，保質(zhì)期25 d。官方信息標(biāo)注該酸奶只含副干酪乳桿菌。本實(shí)驗(yàn)在酸奶距離生產(chǎn)日期12 d時(shí)進(jìn)行。

1.1.2 培養(yǎng)基

MC培養(yǎng)基購自環(huán)凱微生物科技公司。將MC培養(yǎng)基干粉32.4 g和瓊脂粉6 g溶于400 mL蒸餾水中，攪至溶解，于121 ℃高壓滅菌15～20 min。搖晃錐形瓶，使碳酸鈣均勻分布，待其冷卻至約70 ℃，于超凈工作臺上打開瓶塞，注入一次性培養(yǎng)皿中約15 mL，待培養(yǎng)基凝固。將制備好的培養(yǎng)基于4 ℃冰箱內(nèi)保存待用。

1.2 方法

1.2.1 不同pH鹽酸的制備

取pH值1的滅菌鹽酸100、10 μL，分別加入900、990 μL的滅菌生理鹽水，配制成pH值2和3的鹽酸[4]。

1.2.2 樣品前處理

試驗(yàn)設(shè)置酸處理組(pH值為1、2、3)，對照組，共4個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。酸處理組：取3份100 μL的酸奶(酸奶溫度為4 ℃)，分別加入pH值1、2、3的滅菌鹽酸900 μL。對照組：取100 μL的酸奶(酸奶溫度為4 ℃)，加入900 μL的滅菌生理鹽水。每個(gè)組分別設(shè)置3個(gè)重復(fù)。為模擬酸奶在胃內(nèi)停留的時(shí)間，將樣品充分混勻后，37 ℃搖床振蕩30 min[5]。

1.2.3 樣品的稀釋涂布

取各處理樣品，加入滅菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，稀釋至10-2、10-3、10-4、10-5倍。取各稀釋樣品200 μL，均勻涂于MC培養(yǎng)基上。取2個(gè)空白培養(yǎng)基，一個(gè)未暴露于空氣，另一個(gè)暴露于空氣中1 h。

1.2.4 細(xì)菌的分離培養(yǎng)

將試驗(yàn)組和對照組于37 ℃恒溫下培養(yǎng)48～72 h。

1.2.5 細(xì)菌的鑒定

對具有乳酸菌典型特征的菌落，用接種環(huán)在培養(yǎng)基上挑取2～3個(gè)單菌落進(jìn)行革蘭染色鏡檢。乳酸桿菌在MC培養(yǎng)基中菌落特征為菌落較小，白色或淡粉色，邊緣不太整齊，可有淡淡的暈，直徑(2±1)mm。乳酸桿菌鏡下菌體形態(tài)呈長桿狀或短桿狀，且大多為兩兩相連排[6]。結(jié)合菌落特征和鏡檢特征，可確定乳酸桿菌。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

對平板上符合乳酸桿菌菌落特征的菌落進(jìn)行肉眼計(jì)數(shù)，并記錄計(jì)數(shù)結(jié)果，計(jì)算每個(gè)處理?xiàng)l件下的平均菌落數(shù)。選取菌落數(shù)為30～300的平板，計(jì)算未稀釋樣品的活菌濃度及存活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落與革蘭染色特征

實(shí)驗(yàn)組所有培養(yǎng)基均長出具有乳酸菌特征的菌落，對其進(jìn)行粗略計(jì)數(shù)，可知各組隨稀釋度增大，菌落數(shù)量明顯下降；稀釋度較小，菌落分布與涂布軌跡相吻合。菌落特征為圓球形稍隆起，直徑約1 mm，淡粉色，表面光滑，邊緣不太整齊，半透明，與文獻(xiàn)報(bào)道的乳酸菌特征相同[6]。鏡下特點(diǎn)為革蘭染色陽性，短桿狀，單生或兩兩相連，偶V字排開，無莢膜無芽孢。對照組中未暴露于空氣的培養(yǎng)基無菌落生成，暴露于空氣1 h的培養(yǎng)基長有許多雜菌。綜上，可確定實(shí)驗(yàn)組中的菌落為乳酸菌。

2.2 菌落計(jì)數(shù)及變化規(guī)律

采用10倍梯度稀釋在37 ℃恒溫下對乳酸菌培養(yǎng)48～72 h，得到不同處理?xiàng)l件下的平均菌落數(shù)(表1)，并計(jì)算酸奶中乳酸菌的活菌濃度和存活率(表2)。

表1 不同pH處理下酸奶中菌落計(jì)數(shù)

注：不可計(jì)數(shù)是指通過肉眼難以進(jìn)行準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。

表2 不同pH處理下酸奶中乳酸菌的活菌濃度和存活率

由表2可知，與對照組相比，酸處理組的活菌數(shù)均顯著降低。結(jié)果表明，pH值1～3的酸性環(huán)境均能抑制乳酸菌的生長；當(dāng)pH值≤3以下時(shí)，pH值越小，抑制作用越強(qiáng)。乳酸菌具有一定的耐酸能力，pH值3時(shí)耐酸能力相對較好， pH值1時(shí)耐受能力相對較差。

3 小結(jié)與討論

酸奶中乳酸菌一般含乳桿菌屬、嗜熱鏈球菌屬、雙歧桿菌。除雙歧桿菌為嚴(yán)格厭氧型外，其余為兼性厭氧型。乳酸菌具有一定的耐酸能力，在pH值1～3時(shí)，pH越小，對乳酸菌的抑制作用越強(qiáng)。已有研究發(fā)現(xiàn)，人空腹時(shí)胃內(nèi)pH值為1～2，餐后因胃液被食物稀釋，pH值上升。餐后0.5 h，胃內(nèi)pH值為3.5～4.0；餐后1 h，胃內(nèi)pH值為4.0～5.0；餐后1.5 h，胃內(nèi)pH值為3.0～4.0；餐后2 h，胃內(nèi)pH值為2.0～3.0[7]。建議酸奶的最佳飲用方式為餐后0.5～1.5 h內(nèi)飲用，避免餐前空腹喝酸奶。