李霄揚，黃明珠，張旭，于兵

作者單位：中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院放射科，沈陽，110001

近年來的一系列研究發(fā)現(xiàn)，多巴胺受體D4基因啟動子區(qū)-616 位點(rs747302)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)可能與多種兒童精神異常，如注意缺陷多動障礙，原發(fā)性夜間遺尿癥[1-2]等的發(fā)病具有相關性，但是rs747302基因多態(tài)性對正常青春期兒童腦微結構，特別是白質微結構的研究，截至目前未見相關報道。

擴散磁共振成像技術通過施加不同參數的梯度脈沖，以測量微米數量級的水分子擴散差異，從而計算出細胞完整性和組織微結構等信息，是目前唯一有能力在活體無創(chuàng)地檢測腦白質微結構的影像學手段。擴散張量成像是目前最經典且臨床應用最廣泛的技術，它對于腦白質微組織結構異常具有較好的敏感性，但是特異性不夠強，腦白質微觀結構的某些特性有時會被掩蓋，例如，擴散張量成像反映的微結構的各向異性差異往往被方向分散所掩蓋。只有區(qū)分出這些特性，才能夠對樹突和軸突的微結構進行深入的無創(chuàng)性的探索。

Zhang等[3]基于磁共振擴散成像掃描開發(fā)的神經突方向分散度和密度成像(neurite orientation dispersionand density imaging，NODDI)技術，為臨床實現(xiàn)神經突(樹突和軸突)的微結構檢測提供了全新的渠道。因而，本研究計劃使用NODDI技術，探索rs747302基因對正常青春期兒童腦白質微結構的影響。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本研究根據rs747302基因型檢測結果以及患者的性別、年齡狀況，在2016年1月至2018年12月期間，選取182名年齡11～13歲，神經系統(tǒng)發(fā)育正常的青春期兒童。該研究計劃已經獲得我院倫理委員會審查批準(批準號2015PS54)，所有參與研究的被試者本人及其父母(父母不具備民事行為能力時由其法定監(jiān)護人代理)均簽署了相應的知情同意書。

所有參與研究的青春期兒童入組標準如下：神經和精神系統(tǒng)問診及查體正常，無血液系統(tǒng)、神經系統(tǒng)疾病及精神疾病病史；常規(guī)MRI檢查腦實質未見異常；無睡眠呼吸異常病史；無典型精神及精神藥物服用史，由具備資質的心理科醫(yī)師進行韋氏智力測驗后確認智商(intelligence quotient，IQ)＞8。

1.2 數據采集

1.2.1 rs747302基因型分析

所有受試兒童常規(guī)采集5 ml外周靜脈血，并采用EDTA抗凝，用碘化鉀法從外周血淋巴細胞中提取基因組DNA用于后續(xù)檢測。rs747302 SNP分析采用PCR技術，使用 ABI 9700 PCR擴增儀檢測rs747302基因C/G多態(tài)性，PCR反應的引物設計及PCR反應條件詳見表1。由于人群中rs747302基因的CC純合子分布頻率很低，因而本研究中將CC和CG基因型的被試合并為C等位基因攜帶組(C組)，與G純合子被試兒童(G組)進行組間對比。

1.2.2 韋氏智力測驗

韋氏智力測驗采用湖南醫(yī)科大學龔耀先等修訂的韋氏兒童智力量表(C-WISC)[4]。所有受試者均完成11項分測驗，其中言語分測驗6項包括知識(I)、領悟(C)、分類(S)、算術(A)、數字廣度(D)、詞匯(V)；操作分測驗5項包括填圖(PC)、圖片排列(PA)、木塊圖(BD)、圖形拼湊(OA)、編碼(Cd)。從分測驗中分別獲得言語量表分(V)、操作量表分(P)及總量表分(F)。進一步計算言語智商(VIQ)、操作智商(PIQ)、總智商(IQ)，3個因子智商：言語理解因子(VC)=I+V+C+S、知覺組織因子(PO)=PC+PA+BD+OA、記憶/不分心因子(M/C)=A+D+Cd。

1.2.3 磁共振掃描數據處理

NODDI掃描采用Philips Ingenia 3.0 T超導型MRI掃描儀，使用64通道頭線圈進行掃描。NODDI 掃描采用多層同時成像(Multi-Band SENSE)自旋平面回波(SEEPI)序列，掃描參數：TR 4000 ms，TE 85 ms，反轉角90°，SENSE加速因子為P=2.5，Multi-Band加速因子為2，F(xiàn)OV 220 mm×220 mm，掃描矩陣110，層厚2 mm，層間距0 mm，層數54層，b值為0、1000 s/mm2及2000 s/mm2，每個b值下擴散敏感梯度方向32個。NODDI序列掃描時間為7 min。

從MRI掃描儀導出NODDI掃描的原始圖像，在由專業(yè)的神經組放射科醫(yī)師目視觀察去除形變和頭動明顯的被試數據后，首先應用FSL (https://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/)軟件包對NODDI數據進行渦流頭動校正和剝腦預處理，然后應用倫敦大學Hui Zhang教授團隊編寫，的NODDI Matlab Toolbox (V0.9)(http://mig.cs.ucl.ac.uk/index.php?n=Download.NODDI)軟件包，計算得到突觸體積分數(neurite density index，NDI)、神經突方向分散系數(orientation dispersion index，ODI)等NODDI指標圖。

為進一步計算白質NODDI指標的組間差異，本研究采用FSL基于纖維束示蹤的空間統(tǒng)計分析(Tract-Based Spatial Statistics，TBSS)組件，對NODDI指標圖(NDI和ODI圖)進行深入分析，具體步驟如下：首先應用FSL DTIFIT組件，根據預處理后的NODDI數據中的b=700s/mm2，32個彌散梯度方向的掃描數據，計算每名被試的部分各向異性圖；然后應用FMRIB Non-linear Registration Tool工具包，將各向異性圖配準到蒙特利爾神經研究所(Montreal neurological institute，MNI)空間；之后應用TBSS軟件包根據配準后的部分各向異性圖得到平均部分各向異性圖纖維骨架圖像；最后，將所有被試的NODDI指標圖(NDI和ODI圖)映射到平均部分各向異性圖纖維骨架上，得到每個被試的ODI纖維骨架圖和ODI纖維骨架圖。

1.2.4 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 17.0軟件包(SPSS Inc.，Chicago，IL，U S A)對被試數據進行分析。首先采用Kolmogorov–Smirnov檢驗對于所有的定量數據進行正態(tài)性分布檢驗，符合正態(tài)分布的數據用均值±標準差表示，不符合正態(tài)分布的數據則以中位數(四分位間距)表示。采用Student’st檢驗或Mann-Whitney U檢驗對于年齡、受教育程度進行各組間比較，采用Chi-square檢驗比較性別的各組間差異，以P＜0.05作為組間差異具有統(tǒng)計學意義。

由于韋氏智力測驗的部分結果為非正態(tài)分布，所以我們采用Mann-Whitney U檢驗對智力測驗的結果進行組間比較，并采用Bonferroni法進行多重比較校正，以校正后P＜0.05作為差異有統(tǒng)計學意義。

為了探索不同基因型被試白質微結構的組間差異，本研究應用FSL的Randomize組件，將性別、年齡受教育程度和IQ作為協(xié)變量，采用置換檢驗(置換次數5000次)分別對于NDI和ODI的纖維骨架圖進行基于纖維束示蹤的組間分析，組間分析結果采用參考簇水平(threshold-free cluster enhancement，TFCE)方式進行多重比較校正，將校正后P＜0.05的白質區(qū)域作為組間差異顯著。根據約翰霍普金斯大學ICBM-DTI-81白質纖維圖譜定位組間差異顯著的白質纖維束。

表1 rs747302基因型分析引物及反應條件Tab. 1 Protocol of rs747302 genotyping

表2 所有被試DRD4 -616位點基因檢測結果Tab. 2 The results of genotyping of DRD4 -616 C/G SNP

表3 所有被試基本情況Tab. 3 Demographic data of the participants

為了深入分析NODDI指標的組間比較結果，我們分別將NDI和ODI組間差異顯著的白質區(qū)域作為感興趣區(qū)，提取所有被試感興趣區(qū)內的NODDI指標進行組間比較，并且采用Spearman相關分析的方法，探索感興趣區(qū)內NODDI指標與韋氏智力測驗的相關性。

2 結果

4名被試兒童的NODDI影像數據形變或頭動明顯，其基因型數據和影像數據被排除。列入統(tǒng)計的被試基因檢測結果見表2，他們的年齡和接受教育時間未見組間差異，但是C等位基因攜帶者的記憶/不分心因子顯著低于G純合組，詳見表3、4。

基于TBSS組間分析結果顯示，rs747302基因C/G SNP導致的被試白質組間差異主要位于雙側丘腦前輻射(anterior thalamic radiation，ATR)，表現(xiàn)為ODI的升高及NDI的減低(P＜0.05，TFCEcorrected)(圖1)。分別將NDI和ODI組間差異顯著的ATR白質區(qū)域作為感興趣區(qū)，提取所有被試感興趣區(qū)內的NODDI指標進行組間比較，發(fā)現(xiàn)C等位基因攜帶者的ATR的ODI值顯著高于G純合組，而且NDI顯著低于G純合組(U=120，P＜0.001；U=890，P＜0.001)。Spearman相關分析的結果顯示，C等位基因攜帶者的NDI值與記憶/不分心因子正相關(r=0.6804，P＜0.001) (圖2)。

表4 韋氏智力測驗結果Tab. 4 Intelligence testing results of the participants

圖1 rs747302基因多態(tài)性對白質NODDI參數的影響 圖2 rs747302對ATR NODDI參數的影響極其與注意/不分心因子的聯(lián)系 Fig. 1 Effect of rs747302 gene on NODDI parameters of white matter. Fig. 2 Effect of rs747302 gene on NODDI parameters of ATR and its relationship with M/C factor.

基于纖維束示蹤的組間分析結果顯示，rs747302基因C/G SNP導致的被試白質組間差異主要位于雙側丘腦前輻射(anterior thalamic radiation，ATR)，表現(xiàn)為ODI的升高及NDI的減低。

組間分析結果顯示：(A) C等位基因攜帶者ATR的NDI值顯著低于G純合組；(B) C等位基因攜帶者ATR ODI顯著高于G純合組；(C) C等位基因攜帶者記憶/不分心因子顯著低于G純合組；(D) C等位基因攜帶者的NDI值與記憶/不分心因子正相關(r=0.6804；P＜0.001)。

3 討論

NODDI建立了一個可以區(qū)分細胞內間隔、細胞外間隔和腦脊液等三種微結構環(huán)境的組織結構模型：細胞內間隔指神經突膜環(huán)繞的空間。在腦組織內，細胞內間隔模擬的神經方向的范圍包括方向高度一致的白質結構(如胼胝體)、彎曲或者呈輻射狀的白質結構(如半卵圓中心)和向各個方向蔓延為特征的皮層和皮層下灰質結構；細胞外間隔)細胞外間隔是指神經周圍的空間，它被各種類型膠質細胞和灰質中的細胞體所占據。在這個空間里，水分子的擴散被神經突起所阻礙，而不是僅僅受限。因此，用簡單的各向異性擴散模擬細胞外間隔。CSF(腦脊液)是指腦脊液所占據的空間。這個空間用各向同性的符合高斯分布的擴散來描述?，F(xiàn)有的研究表明，相對于傳統(tǒng)的擴散張量成像模型，NODDI模型于白質的微結構有著更高的靈敏性和特異性[5]。

rs747302基因位于DRD4基因啟動子區(qū), 存在轉錄調控蛋白AP-2的結合位點，而該位點C、G等位基因的多態(tài)性[6]，可能影響AP22結合位點的活性,從而影響了DRD4基因的誘導及轉錄，進而造成一些DRD4蛋白結構與功能的變化[4，7]。

本研究結果顯示，rs747302基因主要造成了雙側ATR的白質微結構改變,而且ATR的NDI改變與C等位基因攜帶者的注意/不分心因子相關。ATR結構主要連接丘腦以及額葉，是額葉-丘腦神經環(huán)路的重要聯(lián)絡纖維，而額葉-丘腦神經環(huán)路對于注意力的維持、睡眠/覺醒狀態(tài)的切換以及排尿行為的控制都起著重要的作用[8]。考慮已有研究證實ADHD和遺尿癥的額葉-丘腦結構連接及功能連接均存在異常[9-11]，筆者推測C等位基因攜帶者的ATR微結構改變可能造成了他們ADHD和遺尿癥發(fā)病的風險相對升高；考慮到ATR的NDI改變與C等位基因攜帶者的注意/不分心因子減低具有相關性，可能表明rs747302基因的多態(tài)性，與ADHD患者的注意力不集中以及以前研究中發(fā)現(xiàn)的PNE患兒注意缺陷可能存在一定的關聯(lián)性[12]。

本研究還表明C等位基因攜帶者的ATR ODI值升高且NDI減低，這表明C等位基因攜帶者的ATR部分區(qū)域神經突總體積減小，而且神經突的排列比較分散?；谝酝膭游飳嶒炑芯拷Y果，筆者推測rs747302基因的C等位基因影響了DRD4蛋白的表達，從而干擾了腦發(fā)育過程中突觸連接修剪的過程，進而影響了C等位基因攜帶者ATR白質的神經突微結構，造成了他們ATR的部分區(qū)域白質神經突減少，由于ATR神經突的總體積減小，所以這些神經突在相對大的空間內可能分布排列也較G組分散[6]。

本研究還存在較多局限性，首先，因為樣本量及C等位基因比率所限，我們在研究中對CC和CG基因型的合并可能造成一定程度的遺傳效應混淆；其次，考慮到青春期兒童的生長發(fā)育變化比較劇烈，我們將被試的年齡限制在較小的范圍內，因此我們還需要在以后對更大年齡范圍內進行深入研究和長期隨訪，以驗證rs747302基因SNP對于不同生長發(fā)育階段兒童腦白質微結構的影響。

利益沖突：無。