楊宇琦，楊凌宇，吳曉莉，厲含之，陳予東，劉麗旭

(中國(guó)康復(fù)研究中心神經(jīng)康復(fù)科，北京 100068)

血管性認(rèn)知障礙(vascular cognitive impairment,VCI)包括與腦血管疾病相關(guān)或由腦血管疾病引起的輕至重度認(rèn)知障礙，是腦血管病常見(jiàn)的并發(fā)癥[1]。隨著人口老齡化的進(jìn)展，VCI逐漸加重家庭及社會(huì)的負(fù)擔(dān)。人口老齡化和老年人群中VCI的高發(fā)病率都將導(dǎo)致未來(lái)30年VCI患者數(shù)量將大幅增長(zhǎng)[2]。既往研究強(qiáng)調(diào)認(rèn)知功能障礙可能是腦血管病最早、最常見(jiàn)、最敏感的表現(xiàn)，并提出認(rèn)知功能障礙可作為一種預(yù)后指標(biāo)[3]。事實(shí)上，早期發(fā)現(xiàn)細(xì)微的認(rèn)知減退并不容易，VCI在治療過(guò)程中不能停止或逆轉(zhuǎn)認(rèn)知功能障礙，只能在減緩認(rèn)知衰退進(jìn)程的較晚階段被發(fā)現(xiàn)[4]。因此，本研究采用前期課題組發(fā)明的操作性條件反射箱對(duì)大鼠進(jìn)行電擊刺激建立動(dòng)物傷害性刺激的操作性條件反射，觀察VCI大鼠的行為學(xué)特征，同時(shí)通過(guò)觀察腦組織的超微結(jié)構(gòu)，研究操作性條件反射箱對(duì)評(píng)估VCI大鼠執(zhí)行功能的意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

條件反射箱(專(zhuān)利號(hào)：ZL 200910084240.3，張通教授設(shè)計(jì)，上海吉量公司制造)：箱體外壁長(zhǎng)×寬×高=37 cm×27 cm×45 cm，內(nèi)壁長(zhǎng)×寬×高=35 cm×25 cm×40 cm，箱體壁厚1 cm(銅棒中心到頂板/攝像頭的高度為32 cm)；DigBehv 動(dòng)物行為分析系統(tǒng)(上海吉量軟件公司)；Morris水迷宮儀(上海吉量公司)。成年Sprague-Dawley 大鼠(n=50,雌雄各半，體重260～280 g)購(gòu)自中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK-(軍)2002-001。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物建立反射及分組 50只SD大鼠飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)，室溫22～26 ℃，標(biāo)準(zhǔn)12 h光/暗循環(huán)晝夜交替，固定飼料喂養(yǎng)，自由飲食。觀察動(dòng)物精神活潑、反應(yīng)靈敏、體形正常、毛色光澤者可納入實(shí)驗(yàn)。將大鼠放入條件反射箱中，熟悉環(huán)境1 min，1 min后箱底通電，反射箱底通電后，設(shè)定電壓為35 V，刺激時(shí)間為10 min。觀察到大鼠自發(fā)畏縮、豎毛、舉尾、并隨電壓增加出現(xiàn)跳躍甚至嘶叫等，在箱內(nèi)無(wú)目地跑動(dòng)，會(huì)多次無(wú)意踩踏板裝置而中斷電流解除電流刺激，反復(fù)多次后，大鼠學(xué)習(xí)到如何避免傷害性刺激。以壓操縱桿時(shí)間超過(guò)刺激時(shí)間的90%為建立反射成功。對(duì)大鼠進(jìn)行持續(xù)4 d的條件反射，在操作中盡量保證大鼠不受到驚嚇與注意力的轉(zhuǎn)移。最后，選取建立操作性條件反射成功大鼠45只，隨機(jī)分為模型組15只，假手術(shù)組15只，空白對(duì)照組15只。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大腦中動(dòng)脈缺血再灌注損傷模型制備 采用線栓法對(duì)模型組進(jìn)行大腦中動(dòng)脈(middle cerebral artery,MCA)缺血再灌注手術(shù)，該模型均對(duì)左側(cè)進(jìn)行栓塞，以大鼠出現(xiàn)呼吸、心跳加快，甚至出現(xiàn)尿失禁，即為MCA起始處栓塞成功[5]。栓塞后縫合，缺血2 h拉出線栓灌注。假手術(shù)組同上，但栓線只到頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈的分叉處。術(shù)后觀察大鼠行為變化，無(wú)異常后繼續(xù)飼養(yǎng),自由飲食。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物執(zhí)行功能測(cè)定 將手術(shù)干預(yù)后的3組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在術(shù)后48 h放入條件反射箱，施以35 V電壓和10 min刺激時(shí)間的電擊，觀察壓桿的時(shí)間、活動(dòng)的軌跡和路程，并通過(guò)視頻觀察活動(dòng)情況。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Morris水迷宮檢測(cè) 對(duì)各組大鼠進(jìn)行Morris水迷宮檢測(cè)，觀察各組大鼠的行為學(xué)改變，通過(guò)空間探索試驗(yàn)和定位航行試驗(yàn)來(lái)進(jìn)行[6]。訓(xùn)練共6 d，上午及下午各訓(xùn)練4次，定位航行試驗(yàn)中觀察大鼠2 min內(nèi)找到平臺(tái)的時(shí)間，記錄逃避潛伏期，定位航行試驗(yàn)結(jié)束后撤除平臺(tái)，進(jìn)行空間探索試驗(yàn)。任選一個(gè)相同入水點(diǎn)將各組大鼠分別放入水中，在2 min內(nèi)觀察并記錄大鼠跨越原平臺(tái)象限的次數(shù)。比較各組大鼠的逃避潛伏期和跨越次數(shù)，若模型組與其他兩組之間存在差異，則提示該模型造模成功[7]。

1.2.5 觀察各組大鼠感覺(jué)運(yùn)動(dòng)皮層的超微結(jié)構(gòu) 參照Woolsey的新皮層機(jī)能分區(qū)法和神經(jīng)系統(tǒng)解剖圖取左側(cè)運(yùn)動(dòng)感覺(jué)皮層處直徑1 mm的組織塊制作電鏡標(biāo)本：2%多聚甲醛、2%戊二醛溶液中固定2 h，經(jīng)0.l mol磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)沖洗，再經(jīng)1%四氧化鋨酸固定2 h，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，梯度乙醇脫水，Epon812環(huán)氧樹(shù)脂包埋，制備超薄切片，經(jīng)醋酸雙氧-枸櫞酸鉛染色。每份標(biāo)本制作3張銅網(wǎng)。PhihPsCMor透射電鏡(首都醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所)檢測(cè)標(biāo)本，觀察運(yùn)動(dòng)感覺(jué)皮層的神經(jīng)病理變化，AGFA數(shù)碼相機(jī)拍照，定性分析標(biāo)本病理學(xué)變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠Morris水迷宮檢測(cè)結(jié)果

假手術(shù)組與對(duì)照組的平均逃避潛伏期、跨越次數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.944、0.346，P=0.062、0.732)。模型組的平均逃避潛伏期均大于假手術(shù)組和對(duì)照組(t=28.488、22.490，P<0.001)，而平均跨越次數(shù)均少于假手術(shù)組和對(duì)照組(t=15.255、9.475,P<0.001)，提示該模型造模成功。見(jiàn)表1。

2.2 各組大鼠在操作性條件反射箱中的測(cè)試結(jié)果

在反射箱中，假手術(shù)組與對(duì)照組的平均壓桿時(shí)間、路程相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。模型組的壓桿時(shí)間均低于假手術(shù)組和對(duì)照組，而活動(dòng)路程參數(shù)均高于假手術(shù)組和對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見(jiàn)表2。

表1 各組大鼠平均逃避潛伏期、跨越次數(shù)的檢測(cè)結(jié)果

*P<0.001，與假手術(shù)組比較；#P<0.001，與對(duì)照組比較。

表2 各組大鼠操作性條件反射箱測(cè)試結(jié)果

*P<0.001，與假手術(shù)組比較；#P<0.001，與對(duì)照組比較。

2.3 大鼠腦組織超微結(jié)構(gòu)的變化

經(jīng)電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，模型組運(yùn)動(dòng)感覺(jué)皮層發(fā)生了神經(jīng)細(xì)胞固縮、破裂，胞核固縮移位，新生突觸形成，髓鞘疏松等一系列病理變化，而假手術(shù)組及對(duì)照組則無(wú)上述變化。見(jiàn)圖1。

3 討論

絕大多數(shù)急性腦卒中病例是因供血?jiǎng)用}血管閉塞引起的，而由血管破裂伴相關(guān)出血引起的急性腦卒中只占少數(shù)，約15%。局灶性腦缺血所導(dǎo)致的腦損傷的程度取決于許多因素，例如缺血的嚴(yán)重程度、持續(xù)時(shí)間或者重要的側(cè)支血流量[8]。VCI發(fā)病率逐年上升，然而它的發(fā)病機(jī)制尚不明確，臨床治療上仍缺乏明確、高效的藥物和治療方法。因此，VCI 動(dòng)物模型的有效建立和認(rèn)知功能的成功檢測(cè)對(duì)研究VCI的發(fā)病機(jī)制、藥物治療有著重要意義。目前，嚙齒類(lèi)動(dòng)物在VCI模型中應(yīng)用最為廣泛，本研究選用了近年來(lái)國(guó)內(nèi)外常用的一種大腦中動(dòng)脈缺血再灌注損傷法來(lái)制作VCI 動(dòng)物模型[9-10]。同時(shí)，采用已有30多年研究歷史的Morris水迷宮來(lái)客觀評(píng)價(jià)VCI動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶功能，該方法是研究動(dòng)物海馬損害后的空間學(xué)習(xí)記憶能力變化的行為學(xué)方法，也是評(píng)價(jià)VCI動(dòng)物模型認(rèn)知功能障礙的最重要行為學(xué)方法[11-12]。

Morris水迷宮主要檢測(cè)的是記憶力及空間學(xué)習(xí)能力，通過(guò)行為學(xué)改變來(lái)體現(xiàn)。然而，水迷宮缺乏對(duì)執(zhí)行功能的檢測(cè)，對(duì)實(shí)驗(yàn)室的條件和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體力要求比較高，老年大鼠及造模手術(shù)后大鼠完成檢測(cè)較困難。因此，本研究應(yīng)用Morris水迷宮檢測(cè)VCI大鼠造模成功，模型組的平均逃避潛伏期均大于假手術(shù)組和對(duì)照組，而平均跨越次數(shù)均少于假手術(shù)組和對(duì)照組(P<0.05)。采用前期課題組發(fā)明的能使大鼠形成穩(wěn)定條件反射且能檢測(cè)局灶性缺血大鼠淺感覺(jué)障礙的操作性條件反射箱來(lái)檢測(cè)VCI大鼠的執(zhí)行功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組在反射箱中的壓桿時(shí)間均低于假手術(shù)組和對(duì)照組，而活動(dòng)路程參數(shù)均高于假手術(shù)組和對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示該試驗(yàn)裝置能夠檢測(cè)VCI大鼠的執(zhí)行功能。

以往大量研究[13-14]表明，有關(guān)VCI的主要致病機(jī)制包括了炎癥、氧化應(yīng)激、突觸結(jié)構(gòu)和功能異常、中樞膽堿能及單胺能系統(tǒng)神經(jīng)遞質(zhì)功能紊亂、能量代謝障礙等，同時(shí)也描述了缺血再灌注后腦組織的形態(tài)學(xué)變化。然而，目前針對(duì)腦內(nèi)超微結(jié)構(gòu)的研究及觀察鮮有報(bào)道，本研究通過(guò)透射電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)模型組運(yùn)動(dòng)感覺(jué)皮層的一系列病理變化，如：神經(jīng)細(xì)胞固縮、破裂，胞核固縮移位，新生突觸形成，髓鞘疏松等，而假手術(shù)組及對(duì)照組則無(wú)上述變化，這些發(fā)現(xiàn)在一定程度上也驗(yàn)證了行為學(xué)檢測(cè)的結(jié)果?？傊?，本研究發(fā)現(xiàn)操作性條件反射箱能評(píng)估VCI大鼠的執(zhí)行功能，為VCI的早期發(fā)現(xiàn)和治療提供一定的理論依據(jù)。