卞 華, 秦 宇, 虞成華, 張 凱, 王承平, 林毅侃, 楊保剛, 葛 宇*

(1. 上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗技術(shù)研究院, 上海 200233; 2. 上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院, 上海 200093)

獸藥抗生素(veterinary antibiotics)是微生物或高等動植物在生長過程中所產(chǎn)生的具有抗病原體或其他活性的一類次級代謝產(chǎn)物。其中,主要以抗菌活性強、藥動學(xué)優(yōu)良、選擇特異性突出、臨床效果顯著的喹諾酮類、四環(huán)素類、β內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類和咪唑類等廣譜型抗菌藥為主。這些抗生素在治療和預(yù)防動物源性疾病,促進畜禽機體健康生長,以及提高飼料利用效率等方面做出了巨大的貢獻(xiàn)[1]。

抗生素的半衰期不長,但持續(xù)過量的抗生素在動物體內(nèi)大多不被畜禽充分吸收,不完全代謝降解的殘留物對自然生態(tài)的破壞和人體機能的紊亂都有著潛移默化的作用和影響[2]。復(fù)旦大學(xué)重點實驗室,在國際權(quán)威雜志《Environment International》上闡述了兒童尿液中抗生素的嚴(yán)重性,并認(rèn)為抗生素的暴露模式可能是促進脂肪生成并導(dǎo)致兒童肥胖的危險因素之一。一直以來,國際食品法典委員會(Codex Alimentarius Commission, CAC)的MRL2-2015《食品中獸藥最高殘留限量標(biāo)準(zhǔn)》、歐盟的《Commission Regulation (EU) No37/2010》、美國食品藥品管理局(FDA)的《CFR21食品與藥品聯(lián)邦法案》和我國農(nóng)業(yè)部的235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》[3]等都被用來規(guī)范食品中抗生素的使用。李雙等[4]對99種獸藥篩查的研究以及于潔等[5]對120種抗微生物藥物的討論,也為抗生素的監(jiān)控和檢測提供了新的思路。因此,建立一套能同時準(zhǔn)確地測定畜禽中多種抗生素殘留的方法非常必要,這對保證食品質(zhì)量安全具有重要意義。

近些年,超臨界流體萃取技術(shù)(supercritical fluid extraction, SFE)、分子印跡技術(shù)(molecular imprinting polymer, MIP)、QuEChERS技術(shù)等已被報道對抗生素的凈化提取效率有著顯著的效果。張曉光等[6]用在線固相萃取技術(shù)結(jié)合LC-MS/MS測定了10種大環(huán)內(nèi)酯抗生素, Huertas-Pérez等[7]用QuEChERS技術(shù)結(jié)合熒光色譜測定了8種磺胺類抗生素、Dorival-García等[8]用超聲波及固相萃取技術(shù)結(jié)合UPLC-MS/MS來測定牛奶中的喹諾酮類和β內(nèi)酰胺類抗生素。但抗生素的類別較為廣泛,不同類型的畜禽在不同時期使用的抗生素均不同,優(yōu)化一套能同時快速測定動物源性食品中的多組分抗生素殘留的分析方法是提高檢測效率的根本需求。

本實驗探究了各類別抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)和極性強弱,通過優(yōu)化去除水分、蛋白質(zhì)和脂肪類基質(zhì)干擾物的前處理方法,建立了一套能夠囊括多類別、多組分殘留的儀器分析方法,以快速確切地鑒別和定量120種抗生素。該高通量篩查方法靈敏度較高,重復(fù)性優(yōu)良,可對畜禽肉中抗生素含量測定標(biāo)準(zhǔn)的制定提供較為可靠的參考依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

XEVO TQ-XS三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀 (帶電噴霧離子源(ESI))、Acquity UPLC?H-CLASS液相色譜系統(tǒng)(Waters公司);MSZO 204S型電子天平(瑞士Mettler Toleo公司); Centrifuge 5804高速離心機(德國Eppendorf); D-91126多管渦旋振蕩器(德國Heidolph); EZ-2.3 Elite快速溶劑蒸發(fā)儀(英國Genevac); Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore)。

甲醇、乙腈、乙酸乙酯、正己烷均為色譜純(美國Thermo Fisher Chemical);甲酸(色譜純,美國ACS色譜試劑);乙二胺四乙酸二鈉(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)。

50 mL管陶瓷均質(zhì)子、QuEChERS dSPE EMR-Lipid凈化管(美國Agilent); Oasis?PRiME HLB(3 mL/60 mg, 美國Waters)。

本實驗所用的標(biāo)準(zhǔn)品純度均≥98%, 24種喹諾酮100 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、8種抗真菌100 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液;10種青霉素100 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、20種磺胺100 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、12種頭孢100 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、10種大環(huán)內(nèi)酯100 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、17種咪唑類100 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、氨芐西林和苯唑西林標(biāo)準(zhǔn)品(美國A ChemTek公司), 9種四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品和10種咪唑類標(biāo)準(zhǔn)品(德國Dr. Ehrenstorfer公司)。

1.2 樣品前處理

1.2.1提取

準(zhǔn)確稱取均質(zhì)后的試樣5.00 g(精確到0.01 g)于50 mL具塞離心管中,加入5.0 mL Na2EDTA-Mcllvain緩沖液與兩粒陶瓷均質(zhì)子,渦旋3 min至肉呈灰白色糊狀;加入10.0 mL 1.5%(v/v)甲酸乙腈,渦旋3 min,搖床振蕩15 min,加入5 g無水氯化鈉,渦旋2 min,以9 000 r/min離心3 min,收集上清液。殘余物質(zhì)重復(fù)上述甲酸乙腈提取步驟,合并兩次上清液,混合均勻,待凈化。

1.2.2凈化

正己烷液液萃取 將合并后的上清液轉(zhuǎn)移至快速溶劑蒸發(fā)儀中,于45 ℃、10 kPa的條件下,濃縮至干,加入5 mL 25%(v/v)乙腈-水定容液和5 mL正己烷,渦旋2 min,以9 000 r/min離心2 min,取下層液過0.22 μm聚四氟乙烯(poly tetra fluoroethylene,PTFE)濾膜,供UPLC-MS/MS檢測。

Oasis PRiME HLB固相萃取 將合并后的上清液轉(zhuǎn)移至Oasis PRiME HLB柱中,減壓過濾并保持流速為1～2滴/s,直接收集過濾液,轉(zhuǎn)移至快速溶劑蒸發(fā)儀中,于45 ℃、10 kPa的條件下濃縮至干,加入5 mL 25%(v/v)乙腈-水定容液,渦旋2 min,過0.22 μm PTFE濾膜,供UPLC-MS/MS檢測。

QuEChERS固相萃取 取5.0 mL超純水至QuEChERS dSPE EMR-Lipid管中進行活化,渦旋2 min;將合并后的上清液轉(zhuǎn)移至其中,渦旋2 min,再依次加入3.0 g鹽析劑無水氯化鈉和3.0 g脫水劑無水硫酸鈉,渦旋2 min,以9 000 r/min離心3 min,取上清液轉(zhuǎn)移至快速溶劑蒸發(fā)儀中,于45 ℃、10 kPa的條件下濃縮至干,加入5 mL 25%(v/v)乙腈-水定容液,渦旋2 min,過0.22 μm PTFE濾膜,供UPLC-MS/MS檢測。

復(fù)合式凈化 將合并后的上清液轉(zhuǎn)移至Oasis PRiME HLB柱中,減壓過濾并保持流速為1～2 滴/s,直接收集過濾液,轉(zhuǎn)移至快速溶劑蒸發(fā)儀中,于45 ℃、10 kPa的條件下濃縮至干,加入5 mL 25%(v/v)乙腈-水定容液,再次加入3 mL正己烷溶液,渦旋3 min,以9 000 r/min離心2 min,取下層液過0.22 μm PTFE濾膜,供UPLC-MS/MS檢測。

1.3 LC-MS/MS分析條件

液相色譜條件:色譜柱Atlantis?T3柱(100 mm×2.1 mm, 3 μm);柱溫40 ℃;樣品室溫度15 ℃;進樣體積2 μL;流動相A: 0.1%(v/v)甲酸水溶液;流動相B:乙腈;流速0.3 mL/min。梯度洗脫程序:0～1 min, 5%B; 1～16 min, 5%B～75%B; 16～17 min, 75%B～5%B; 17～18 min, 5%B。

質(zhì)譜條件:電噴霧正離子模式(ESI+),多反應(yīng)監(jiān)測(MRM);毛細(xì)管壓力: 3.00 kV;椎孔電壓: 40 V;離子源溫度: 150 ℃;脫溶劑氣溫度: 550.0 ℃;脫溶劑氣流速: 1 000 L/h;反吹氣流速: 150 L/h;碰撞氣流速: 0.15 mL/min;霧化氣壓力: 0.7 MPa。120種抗生素的監(jiān)測離子對(Q1/Q3)、去簇電壓(DP)、碰撞能量(CE)見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜-質(zhì)譜條件優(yōu)化

抗生素多屬于極性化合物,而肉類產(chǎn)品的基質(zhì)干擾組分主要為脂肪類非極性物質(zhì)。因此,本實驗選用了在反相色譜條件下對極性化合物分離效果更佳的Waters Atlantis T3色譜柱。Atlantis T3還可以較好地改善普通C18柱對堿性化合物分離不佳,柱壽命短以及堿性分析物與柱填料上殘留硅醇基發(fā)生次級作用導(dǎo)致峰形惡化的狀況[9]。

乙腈、甲醇作為2種優(yōu)良的極性有機溶劑,對于120種抗生素的洗脫能力沒有本質(zhì)差別。但乙腈需要的柱壓更小,化合物的保留時間更穩(wěn)定。同時,微量的甲酸可以提供ESI源在Q1四極桿內(nèi)離子化所需的H+,從而提高離子化效率,得到更好的色譜峰形和更強的靈敏度。因此以0.1%(v/v)的甲酸水溶液和乙腈作為本實驗的流動相。

表 1 120種抗生素的保留時間、母離子、子離子、去簇電壓和碰撞電壓

表 1 (續(xù))

表 1 (續(xù))

表 1 (續(xù))

表 1 (續(xù))

* Quantitative ion.

將配制的質(zhì)量濃度為1.0 mg/L的8大類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別依次通過注射泵注入質(zhì)譜儀中進行參數(shù)優(yōu)化。本實驗的目標(biāo)化合物均在[M+H]+加合離子模式下采集,分別在Q1和Q3四極桿中優(yōu)化DP和CE值,并選取相對豐度較高的兩個特征碎片離子為定量和定性離子。所有化合物離子的質(zhì)譜響應(yīng)均在106以上,其中喹諾酮、抗真菌、大環(huán)內(nèi)酯和咪唑類化合物的質(zhì)譜響應(yīng)強度較為突出,可能是因為這幾類化合物結(jié)構(gòu)中含氮原子,能夠形成穩(wěn)定的帶電離子[10]。將包含所有化合物(質(zhì)量濃度為1 mg/L)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液再次注入質(zhì)譜儀中進行核查,結(jié)果表明這120種化合物均能在16 min內(nèi)得到良好的色譜峰形。8類抗生素代表化合物的色譜圖見圖1。

圖 1 每類抗生素代表化合物在多反映監(jiān)測模式下的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of the representative target in each antibiotics category with MRM mode

2.2 提取溶劑的條件優(yōu)化

現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)與文獻(xiàn)中,甲醇、乙腈和乙酸乙酯常被用來作為目標(biāo)化合物的提取溶劑。其中,甲醇由于極性過強,提取過程中會帶出較多的雜質(zhì),增加后續(xù)凈化難度,造成干擾峰過多[11];而乙酸乙酯的極性相對較弱,毒性較低,可作為某幾類化合物(磺胺、咪唑類)合適的提取溶劑,但在120種抗生素的篩查檢測過程中,乙酸乙酯對另外6類化合物的提取效率并不理想;乙腈極性范圍寬,分子小,組織穿透能力強,對糖、脂肪、蛋白質(zhì)類化合物的沉淀效果較好,同時對多數(shù)目標(biāo)化合物均有較好的溶解性和較高的提取率[12]。另外,酸能破壞基質(zhì)的細(xì)胞組織結(jié)構(gòu),使目標(biāo)化合物更充分地被分離出來。微量的有機弱酸還能調(diào)節(jié)體系的pH值,抑制化合物酸性基團的解離,從而改變目標(biāo)物在水相-有機相之間的分配比,加強其轉(zhuǎn)移到乙腈層中的效率。在有機弱酸中,甲酸酸性強于乙酸,本實驗最終以甲酸-乙腈為基礎(chǔ)優(yōu)化提取條件。

大部分抗生素在pH 4.0到9.0之間穩(wěn)定,因此,本實驗對提取液中的甲酸體積分?jǐn)?shù)(0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.5%、5.0%)進行了優(yōu)化。結(jié)果表明,隨著甲酸含量的提升,基質(zhì)提取液的顏色由透明色漸變成深褐色,說明其對基質(zhì)的組織結(jié)構(gòu)穿透性越來越強。但當(dāng)甲酸的體積分?jǐn)?shù)在2.5%以上時,大多數(shù)抗生素的回收率顯著下降,在高濃度酸性環(huán)境中,其較容易被酸化降解。隨著甲酸體積分?jǐn)?shù)的上升,基質(zhì)的次級蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可能已經(jīng)發(fā)生改變,5%(v/v)甲酸-乙腈溶液體系已不具有很強的流動性(明膠狀態(tài)),對后續(xù)的凈化過程會造成一定的影響。

圖 2 不同甲酸含量的提取液對抗生素回收率的影響(n=96)Fig. 2 Effect of different formic acid contents on the recoveries of antibiotics (n=96)

喹諾酮、抗真菌和咪唑類抗生素在甲酸的梯度變化中較為穩(wěn)定,回收率沒有很大的波動,穩(wěn)定在70%以上(見圖2)。磺胺和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素屬于堿性化合物,隨著甲酸體積分?jǐn)?shù)的上升,溶液中的H+更容易造成磺胺類抗生素芳伯氨基結(jié)合成配位鍵-NH3+,使其失活,也會促使大環(huán)內(nèi)酯雙環(huán)上由羥基與去氧氨基糖縮合成的堿性苷鍵發(fā)生水解、內(nèi)酯開環(huán)以及脫?；磻?yīng)等,導(dǎo)致其回收率逐漸下降。張科明等[13]在測定豬肉中的獸藥殘留時也發(fā)現(xiàn),當(dāng)酸度過量時,大部分磺胺類待測物都會發(fā)生一定程度的損失,降低提取效率。青霉素類抗生素在酸性條件下的穩(wěn)定性也較差,易受到親電性和親核性試劑的攻擊,致使其失效。酸性較弱時,其電子轉(zhuǎn)移引起分子重排,轉(zhuǎn)變成青霉二酸;酸性較強時,其分子直接裂解,生成青霉胺和青霉醛酸。不過肉類基質(zhì)中的青霉素類抗生素由純乙腈提取的回收率也并不理想,平均回收率不到50%,因此,適量的甲酸對于青霉素類抗生素的提取是必要的。頭孢類抗生素中的內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)構(gòu)相對于青霉素類抗生素更為穩(wěn)定,但在pH低于2.0時,也較容易分解,其回收率在1.5%(v/v)的甲酸乙腈條件下達(dá)到最佳,當(dāng)甲酸體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)上升后,因酸化降解回收率顯著下降。值得一提的是,在酸性有機試劑提取條件下,部分藥物回收率出現(xiàn)先增大后減小的趨勢,也可能是因為甲酸量的加大造成藥物離子化程度增加,當(dāng)超過某臨界點時,其在高比例有機相中的溶解性逐漸減弱[14]。四環(huán)素類抗生素較為特殊,其十分容易和蛋白質(zhì)以及金屬離子配合,只有在偏酸性的環(huán)境中才能抑制配合作用。在甲酸體積分?jǐn)?shù)超過1.5%時,四環(huán)素類抗生素的回收率均可以提升至70%以上。

據(jù)文獻(xiàn)[15]報道,目標(biāo)化合物在由甲酸乙腈提取之前,需用超純水對樣品進行基質(zhì)分散,水具有良好的組織滲透性,能分散樣品,渦旋勻漿后能增加溶劑與樣品的接觸面積,防止樣品在乙腈溶劑中緊縮成一團,包裹住目標(biāo)化合物。本實驗分別考察了5 mL水、Na2EDTA-Mcllvaine緩沖液以及乙酸乙酯試劑對基質(zhì)的分散效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn):乙酸乙酯由于極性低于乙腈,且會降低體系中甲酸的離子化程度,因此不利于大多數(shù)目標(biāo)物的提取,導(dǎo)致喹諾酮、四環(huán)素、β內(nèi)酰胺類和大環(huán)內(nèi)酯類化合物的回收率均有不同程度的下降。相反,Na2EDTA是一種良好的配合劑,不僅能夠有效分散基質(zhì),還能競爭性地配合基質(zhì)中存在的金屬離子,使四環(huán)素和部分喹諾酮類化合物游離出來,在Na2EDTA與無機離子螯合釋放出四環(huán)素后,利用一些酸化劑來調(diào)節(jié)體系的pH值可以更進一步地促進四環(huán)素的提取效率[16]。另外,Na2EDTA的弱電離性也能促進體系的電離平衡,抑制溶液中的酸性離子對磺胺和大環(huán)內(nèi)酯類化合物的沖擊。

本實驗最終選擇5.0 mL Na2EDTA-Mcllvaine緩沖液和20 mL 1.5%(v/v)甲酸乙腈作為復(fù)合提取溶劑。基質(zhì)溶液的pH值穩(wěn)定在4.0左右,滿足大多數(shù)抗生素的穩(wěn)定條件。四環(huán)素類抗生素的回收率提升了近25%,在80%以上?；前贰⒋蟓h(huán)內(nèi)酯和青霉素類化合物的回收率也分別提升了近15%(見圖3)。(在提取溶劑的優(yōu)化過程中,均由正己烷凈化,均在同一溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線下校正和比較)。

圖 3 不同基質(zhì)分散溶液對抗生素回收率的影響(n=96)Fig. 3 Effect of different dispersing solutions on the recoveries of antibiotics (n=96)

2.3 凈化方式的優(yōu)化

由于肉類樣品的基質(zhì)較為復(fù)雜,選擇合適的凈化方式除去多余雜質(zhì)從而降低基質(zhì)效應(yīng)對于提高目標(biāo)物的回收率至關(guān)重要。本文考察了傳統(tǒng)正己烷液液萃取凈化以及新型的Oasis PRiME HLB柱和QuEChERS粉包的固相萃取凈化效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn),抗真菌類和咪唑類化合物在3種凈化方式下都較為穩(wěn)定,但其他類抗生素由QuEChERS凈化后所得的結(jié)果要小于另外兩種方法(見圖4),其中喹諾酮和大環(huán)內(nèi)酯類化合物的回收率下降顯著。這可能與QuEChERS粉包的主要成分有機硅烷鍵合硅膠對于喹諾酮和大環(huán)內(nèi)酯含氮雙環(huán)結(jié)構(gòu)的影響有關(guān),也可能與QuEChERS粉包難以克服的壁面損失和吸附作用有關(guān)。由于獸藥殘留基質(zhì)復(fù)雜,獸藥化學(xué)性質(zhì)各異,QuEChERS對多類別強極性化合物的凈化效果還有待被確認(rèn)和完善[17]。Oasis PRiME HLB通過式固相萃取柱能有效除去蛋白質(zhì)、脂肪和磷脂類基質(zhì)干擾物,相對于普通HLB固相萃取柱,其無需活化、平衡等步驟,操作簡單,耗時更短。結(jié)果表明,Oasis PRiME HLB柱與正己烷兩種凈化方式對于目標(biāo)物的提取效率無明顯差別,前者對于四環(huán)素和大環(huán)內(nèi)酯的凈化效果略有優(yōu)勢,而后者較有利于磺胺和β內(nèi)酰胺類化合物。本實驗進一步探究了由Oasis PRiME HLB凈化濃縮定容后,再加入3 mL正己烷進行二次除脂,以此復(fù)合法凈化后的溶液更為澄清,其回收率要比單一的凈化方式所得的結(jié)果提升6%左右(見圖4),部分β內(nèi)酰胺類目標(biāo)物的峰形也得到了改善,雜質(zhì)干擾更少。實驗證明,Oasis PRiME HLB與正己烷的復(fù)合凈化方式在獸藥的多類別、多組分殘留分析中更為有效。

圖 4 不同凈化方式對抗生素回收率的影響(n=96)Fig. 4 Effect of different purification methods on the recoveries of antibiotics (n=96) Hexane: liquid-liquid extraction (LLE); PRiME HLB: solid phase extraction (SPE); combined: LLE combined SPE.

2.4 方法學(xué)評價

2.4.1基質(zhì)效應(yīng)(ME)

由于肉類基質(zhì)較為復(fù)雜,目標(biāo)化合物經(jīng)過凈化后仍然會有基質(zhì)效應(yīng)存在,需對其影響進行評估。基質(zhì)效應(yīng)主要是由于樣品在離子化時基質(zhì)成分與目標(biāo)化合物相互競爭電離而導(dǎo)致目標(biāo)化合物的質(zhì)譜信號強度有不同程度的增強或減弱。本實驗采用(基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率-1)×100%進行評價,負(fù)值表示存在基質(zhì)抑制效應(yīng),正值表示存在基質(zhì)增強效應(yīng),絕對值越大則基質(zhì)效應(yīng)越強[18]。通常認(rèn)為,基質(zhì)效應(yīng)在±20%內(nèi)為不顯著[19]。結(jié)果表明,部分喹諾酮和咪唑類化合物存在著一定的基質(zhì)增強作用,肉類基質(zhì)對于其余抗生素的質(zhì)譜響應(yīng)強度均呈抑制狀態(tài)。β-內(nèi)酰胺和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的基質(zhì)減弱現(xiàn)象較為明顯,其他抗生素均在-17.81%～15.37%之間(見附表1,http://www.chrom-China.com)。為了降低基質(zhì)效應(yīng)對質(zhì)譜靈敏度和重復(fù)性產(chǎn)生的影響,提升檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性,實驗采用基質(zhì)匹配曲線來考察各項方法學(xué)參數(shù)。

2.4.2線性關(guān)系、檢出限與定量限

以陰性空白樣本制備6個水平的空白基質(zhì)加標(biāo)溶液,以目標(biāo)化合物定量離子的峰面積(Y)為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度(X, μg/L)為橫坐標(biāo)繪制工作曲線。120種抗生素在1.0～ 50.0 μg/L范圍內(nèi)均線性良好。線性相關(guān)系數(shù)(r2)在0.995 3～0.999 9之間,其中89種化合物在0.999 0以上。以定量離子信噪比(S/N)=3計算樣品的檢出限(LOD),S/N=10計算定量限(LOQ)。7種化合物的LOQ為10.0 μg/kg, 21種化合物的LOQ為5.0 μg/kg,其余92種化合物的LOQ均不大于2.0 μg/kg (見附表1)。

2.4.3精密度與回收率

取豬、牛、羊、雞空白樣品,添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,進行96個樣品(4基質(zhì)×6平行×4批次,為期1個月)的加標(biāo)回收率測定。120種抗生素的加標(biāo)回收率平均值在低、中、高3個水平下分別為71.5%～108.8%、72.5%～109.0%和77.7%～109.2%,平均相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.0%～15.3%、1.0%～10.5%和1.1%～4.5%(見表2)。

從表2可以看出,牛肉、雞肉和羊肉的結(jié)果較為理想,回收率較高,穩(wěn)定性較強。豬肉因為脂肪類雜質(zhì)含量較多,基質(zhì)效應(yīng)導(dǎo)致整體回收率偏低5%左右,穩(wěn)定性也略有浮動,但均滿足食品質(zhì)量規(guī)范技術(shù)要求。以上結(jié)果說明本方法的準(zhǔn)確性和精密度均較為理想,能夠滿足多組分、多類別抗生素的定性篩查和定量檢測要求。

表 2 120種抗生素在3個加標(biāo)水平下的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

表 2 (續(xù))

表 2 (續(xù))

All the results shown above are the mean values of 96 samples (n=4(matrixes)×6(parallels)×4(periods)=96).

Levels for antibiotics A, B, E, G and H: low, 2.0 μg/kg; medium, 5.0 μg/kg; high, 10.0 μg/kg. Levels for antibiotics C, D and F: low, 5.0 μg/kg; medium, 10.0 μg/kg; high, 20.0 μg/kg.

2.5 實際樣品檢測

采用所建立的方法,對100批次畜禽產(chǎn)品(豬肉35批次,牛肉25批次,雞肉25批次,羊肉15批次)進行全面的篩查分析。檢出含量較高的有豬肉中的磺胺甲嘧啶(2.97±0.12) μg/kg、恩諾沙星(5.96±0.08) μg/kg;雞肉中的阿苯達(dá)唑-2-氨基砜(7.80±0.37) μg/kg;羊肉中的氟康唑(7.89±0.25) μg/kg。為了驗證本方法的可行性和準(zhǔn)確性,對陽性樣品分別采用相應(yīng)的國標(biāo)方法進行了比較,由GB/T 21316-2007所得出的磺胺甲嘧啶含量為(3.06±0.15) μg/kg,由GB/T 21312-2007所得出的恩諾沙星的含量為(6.19±0.02) μg/kg,由GB 29687-2013所得出的阿苯達(dá)唑-2-氨基砜的含量為(7.62±0.22) μg/kg,氟康唑目前沒有相應(yīng)的國標(biāo)方法,本文參考張凱等[12]的方法測得氟康唑的含量為(7.62±0.14) μg/kg。由此可見,本實驗方法與其對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)方法結(jié)果十分接近,并在檢測時間和適用類別上更有優(yōu)勢,可被用作于獸藥抗生素的定性篩查和定量分析。

3 結(jié)論

本文結(jié)合肉類基質(zhì)特點以及8類抗生素的理化性質(zhì),對前處理方法進行了開發(fā),對儀器方法進行了優(yōu)化,建立了一套復(fù)合式預(yù)處理體系-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,用于同時測定畜禽肉中120種抗生素的殘留。低、中、高3個加標(biāo)水平下的回收率均在70%～110%之間,且重現(xiàn)性良好,能被用于對畜禽肉中絕大多數(shù)獸藥抗生素的快速篩查。該方法在陽性樣品的檢出結(jié)果中與傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)方法基本吻合,且檢測時間更少,鑒定范圍更廣,對于多類別、多組分的獸藥抗生素的檢測具有較高的參考價值。