楊 沫,劉 文,趙新節(jié)

(齊魯工業(yè)大學(xué),山東省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東濟(jì)南 250300)

小芒森(Petit Manseng),又稱小滿勝、佩特蒙森,起源于法國阿奎坦南部比利牛斯大西洋省,果實(shí)皮較厚,顆粒較小,果穗松散,因此即使采收期較晚也不易感染病菌,其糖高達(dá)260～280 g/L,酸低至9～11 g/L,糖高酸低,更適于釀造優(yōu)質(zhì)的甜白葡萄酒,入口圓潤,香氣濃郁,層次感和平衡性出色。冷浸漬一般是指為了浸提果皮中的芳香物質(zhì),獲得更加優(yōu)雅濃郁的香氣,對(duì)除梗破碎后的葡萄原料在一定低溫條件下浸漬的一種釀造工藝[1]。因此冷浸漬工藝不僅能增加葡萄酒色度、色調(diào)、花色苷等酚類物質(zhì)的含量[2],對(duì)香氣物質(zhì)含量更是有著直接影響。葡萄酒的香氣質(zhì)量主要取決于酯醇等化合物的濃度及種類[3],而這些又受酵母種類、葡萄品種及發(fā)酵條件等的影響[4-6]。因此冷浸漬過程中對(duì)于葡萄酒最終品質(zhì)的影響不僅有物理作用還有微生物的作用,尤其是自然條件下附著于小芒森葡萄表面的野生酵母,與葡萄果實(shí)上的真核微生物在低溫條件下的微弱的代謝有關(guān)。但是國內(nèi)研究冷浸漬條件下真核微生物尤其野生酵母以及小芒森葡萄酒香氣成分變化的報(bào)道較少。徐亞男等[7]將非釀酒酵母菌株和工業(yè)菌株混合發(fā)酵赤霞珠葡萄酒,對(duì)香氣成分進(jìn)行分析,但是對(duì)不同非釀酒酵母的特征香氣沒有確切的研究;何娟等對(duì)貴人香冰酒大生產(chǎn)過程中酵母菌群結(jié)構(gòu)及動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了研究分析,發(fā)現(xiàn)了幾株非釀酒酵母,但是對(duì)其存在的機(jī)理及環(huán)境尚不明確[8]。本實(shí)驗(yàn)主要探究在冷浸漬過程中小芒森表皮真核微生物豐度及多樣性的變化以及風(fēng)味物質(zhì)的變化,以期為優(yōu)化小芒森葡萄酒釀造工藝提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小芒森 2016年10月17日采摘于煙臺(tái)蓬萊中糧長城有限公司;釀酒酵母(EC1118)、EX果膠酶 法國Lallemand公司;亞硫酸、4-甲基2-戊醇、3,5-二硝基水楊酸、糖度計(jì)、酒精計(jì) 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;四甲基二戊醇 美國Aldrich公司。

自動(dòng)固相微萃取進(jìn)樣器、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭、7890B氣相色譜-5977A型質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Supelco公司;5L玻璃發(fā)酵罐 四川蜀玻有限公司;DB-WAX毛細(xì)管柱 美國J&W公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小芒森干白葡萄酒釀造工藝 將10 kg小芒森葡萄(19 °Brix)除梗破碎,葡萄醪放置恒溫箱并且控制溫度4 ℃,分別帶皮浸漬1、3、5 d,每個(gè)處理浸漬結(jié)束后取樣(三個(gè)處理以下均用F1、F2、F3表示),浸漬結(jié)束后的葡萄醪進(jìn)行壓榨(皮渣分離),將分離的葡萄汁澄清24 h,按照60 mg/L添加亞硫酸,添加酵母(0.25 g/L)后于18～20 ℃發(fā)酵,約15 d后發(fā)酵結(jié)束后澄清,取樣待測香氣物質(zhì)。

1.2.2 基本指標(biāo)測定方法 葡萄酒基本成分理化指標(biāo)檢測嚴(yán)格按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T15038-2006葡萄酒、果酒通用分析方法》中的方法進(jìn)行檢測。主要包括糖度、酒精度、總酸、還原糖、揮發(fā)酸等指標(biāo)。糖度使用糖度計(jì)測定;酒精度使用酒精計(jì)測定;總酸采用電位滴定法測定;還原糖采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法測定；揮發(fā)酸采用蒸餾-滴定法測定。

1.2.3 微生物分析 對(duì)冷浸漬1、3、5 d分別取樣50 mL,送華大基因檢測樣品中真核微生物含野生酵母菌、真菌、霉菌等的種類及豐度(DNA樣品被接收后,對(duì)樣品進(jìn)行檢測;檢測合格的樣品構(gòu)建文庫:回收目的Amplicon片段,用T4 DNA Polymerase、Klenow DNA Polymerase和T4 PNK將打斷形成的粘性末端修復(fù)成平末端,再通過3′ 端加堿基“A”,使得DNA片段能與3′ 端帶有“T”堿基的特殊接頭連接;或者設(shè)計(jì)合成含有測序接頭的雙Index融合引物,以基因組DNA為模板,進(jìn)行融合引物PCR,磁珠篩選目的Amplicon片段,最后,用合格的文庫進(jìn)行cluster制備和測序)。

1.2.4 揮發(fā)性成分分析 發(fā)酵結(jié)束后的葡萄酒樣品用頂空固相微萃取(Headspace-solid-phase-microextraction HS-SPME)方法預(yù)處理[9],萃取頭為 50/30 μmDVB/CAR/PDMS(Supelco)。用移液器取 4990 μL樣品放入15 mL萃取瓶中,加入20 μL 4-甲基2-戊醇做為內(nèi)標(biāo),加入2 g氯化鈉。萃取瓶置于固相微萃取工作臺(tái)上,35 ℃預(yù)熱10 min,磁力攪拌速度為100 r/min。將固相微萃針插入萃取瓶,推出萃取頭頂空萃取30 min。當(dāng)樣品萃取達(dá)到平衡后,縮回萃取頭,迅速將萃取針插入氣相色譜儀的進(jìn)樣口,推出萃取頭同時(shí)啟動(dòng)氣相色譜儀采集數(shù)據(jù),高溫解析5 min后將萃取頭縮回,拔出。色譜柱升溫程序如下:40 ℃保持8 min,以5 ℃/min升至70 ℃,保持3 min。以5 ℃/min升至230 ℃,保持2 min。進(jìn)樣器250 ℃,檢測器220 ℃,無分流進(jìn)樣。EI離子轟擊,電子能量70 eV;離子源溫度200 ℃;全掃描模式。

1.2.5 揮發(fā)性成分的定性與定量分析 定性分析:分析結(jié)果運(yùn)用計(jì)算機(jī)譜庫(NIST11)進(jìn)行初步檢索和分析,再結(jié)合文獻(xiàn)進(jìn)行人工譜圖解析,確定揮發(fā)性物質(zhì)的各個(gè)化學(xué)成分。定量分析:采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析,計(jì)算結(jié)果為兩年的平均值。計(jì)算公式如下:香氣各組分的含量(μg·g)=[各組分的峰面積/內(nèi)標(biāo)的峰面積×內(nèi)標(biāo)濃度(μg·m L)×1000]/樣品量(g)

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,多組間比較采用One-WayANOVA法。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷浸漬時(shí)間對(duì)小芒森葡萄酒基本指標(biāo)的影響

小芒森冷浸漬1、3、5 d處理發(fā)酵結(jié)束后葡萄酒基本指標(biāo)如表1所示。與冷浸漬1 d與冷浸漬3 d相比,冷浸漬5 d的小芒森葡萄酒的酒精度最高,為16.00 °。冷浸漬3 d的小芒森葡萄酒中的總酸含量及還原糖含量均比冷浸漬1 d和5 d的總酸含量和還原糖含量要高?？梢钥闯?冷浸漬1 d的小芒森葡萄酒中揮發(fā)酸含量比冷浸漬3 d和冷浸漬5 d的要高。葡萄酒的基本指標(biāo)沒有一定的變化規(guī)律,且對(duì)于葡萄酒來講,以上葡萄酒基本指標(biāo)的微小變化對(duì)酒體沒有影響,因此說明冷浸漬時(shí)間對(duì)葡萄酒基本指標(biāo)沒有明顯影響。

表1 不同冷浸漬時(shí)間條件下小芒森葡萄酒基本指標(biāo)Table 1 Basic indicators of Xiaomiansen wine under different cold immersing time conditions

2.2 冷浸漬時(shí)間對(duì)果漿中微生物的影響

如表2,其中,Alpha多樣性(Alpha diversity)是對(duì)單個(gè)樣品中物種多樣性的分析[10],包括Sobs(observed species)指數(shù)、chao指數(shù)、ace指數(shù),shannon指數(shù)以及simpson指數(shù)等,其中simpson指數(shù)最小,說明樣品中的物種越豐富。其中,Sobs指數(shù)、chao指數(shù)和ace指數(shù)反映樣品中群落的豐富度shannon(species richness),即簡單指群落中物種的數(shù)量,而不考慮群落中每個(gè)物種的豐度情況。

表2 樣品Alpha多樣性統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 2 Sample Alpha diversity statistics

根據(jù)表2中樣品Alpha多樣性統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析,冷浸漬1、3、5 d過程中,隨著冷浸漬時(shí)間的增加,Sobs指數(shù)呈增加趨勢,chao指數(shù)及ace指數(shù)呈先減少后增加趨勢,shannon指數(shù)呈增加趨勢,simpson指數(shù)呈減小趨勢。因此綜合分析,shannon指數(shù)的增加、simpson指數(shù)的減小,說明真核微生物物種分類及豐度的變化趨勢為逐漸增加的趨勢,F1到F2增加不明顯,F3中真核微生物的物種數(shù)量最高。

2.3 冷浸漬時(shí)間對(duì)小芒森葡萄酒中的揮發(fā)性物質(zhì)的影響

如表3可知,小芒森干白葡萄酒F1中共檢測出77種,其中包括21種醇類化合物,33種酯類化合物,11種酸類化合物,以及醛酮類、苯類等其他化合物共15種;F2中共檢測出78種揮發(fā)性物質(zhì),其中包括18種醇類化合物,36種酯類化合物,9種酸類化合物,以及15種醛酮類、苯類等其他化合物;F3中共檢測出86種揮發(fā)性物質(zhì),其中包括20種醇類化合物,41種酯類化合物,9種酸類化合物,以及醛酮類、苯類等其他化合物共16種。冷浸漬1、3、5 d處理中,葡萄酒中香氣物質(zhì)總含量分別348.74、345.31、402.5 mg/L。F3中香氣物質(zhì)總含量最高,其中醇類、酯類化合物含量是三個(gè)處理中最高,為酒體帶來濃郁花香果香。F1、F2、F3中含量最高的醇類、酯類、酸類、醛酮類化合物分別為異戊醇、苯乙醇、辛酸乙酯、葵酸乙酯、己酸乙酯、乙酸異戊酯、辛酸和二異丁基酮。

表3 不同冷浸漬時(shí)間條件下小芒森干白葡萄酒中揮發(fā)性物質(zhì)組成及含量(mg/L)Table 3 The composition and the concentrations of the volatile compounds in Petit Manseng dry white wine under different cold maceration time conditions(mg/L)

續(xù)表

續(xù)表

異戊醇具有溶劑味、指甲油味、酒精味[11];苯乙醇具有玫瑰花香、蜜香;辛酸乙酯具有怡人的香蕉、梨的果香氣味;葵酸乙酯具有梨果香氣;己酸乙酯具有香蕉味及青蘋果香氣[12];乙酸異戊酯具有香蕉等果香;辛酸具有奶酪略粗澀的氣味[13];二異丁基酮具有果香及薄荷氣味[14]。因此以上物質(zhì)給予酒體濃郁的花香果香蜜香,其次是略微的草本及脂肪香氣,使得酒體香氣更加豐滿有層次。

本實(shí)驗(yàn)中三個(gè)處理香氣物質(zhì)的變化趨勢是在第5 d達(dá)到最高,尤其是對(duì)酒體花香果香作出重要貢獻(xiàn)的醇類和酯類物質(zhì)在第5 d處理中含量最高。葡萄酒中的香氣有不同的來源,高級(jí)醇、酯和酸等主要香氣物質(zhì)[15-16]屬于發(fā)酵香氣,是發(fā)酵過程中微生物產(chǎn)生的。冷浸漬過程中存在著葡萄果實(shí)上自帶的大量真核微生物,它們生理活動(dòng)也會(huì)對(duì)醇類、酯類揮發(fā)性化合物產(chǎn)生直接影響。真核微生物中不僅有各種真菌,還有多種野生酵母對(duì)葡萄酒的香氣都有著重要貢獻(xiàn)。有研究表明,自然發(fā)酵過程中,葡萄表皮附著的真核微生物中的一些非釀酒酵母屬及其他種屬的酵母均對(duì)葡萄酒香氣物質(zhì)的多樣性和含量的形成具有積極作用[17-18]。

Alpha多樣性統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析,樣品中真核微生物物種數(shù)量的變化趨勢為逐漸增加的趨勢,與F1相比,F2中真核微生物含量略高,F3中明顯高出很多,冷浸漬過程中微生物的豐度及多樣性對(duì)香氣物質(zhì)的數(shù)量及總量產(chǎn)生影響。在低溫浸漬下F1、F2中真核微生物在前三天處于延滯期,又稱為調(diào)整期或適應(yīng)期,因代謝系統(tǒng)適應(yīng)新環(huán)境的需要,物種數(shù)量沒有明顯增加[20],又由于醇類物質(zhì)揮發(fā)性較強(qiáng),如圖1所示F1到F2過程中醇類揮發(fā)性物質(zhì)含量有所下降。F2到F3中的醇類物質(zhì)含量又有所增加,這一時(shí)期醇類化合物中含量變化較大的有異戊醇、(2R,3R)-(-)-2,3-丁二醇、苯乙醇,這可能是由于真核微生物處于快速生長期,較低的浸漬溫度刺激了野生酵母的繁殖合成高級(jí)醇所致[19]。酯類物質(zhì)的合成受酶的調(diào)控,不同酵母菌株酯酶含量不同,則產(chǎn)酯的能力不同[19]。劉峻溪在其野生酵母和商品酵母發(fā)酵葡萄酒中揮發(fā)性成分差異研究中得出結(jié)論,野生酵母會(huì)產(chǎn)生更高的脂肪酸乙酯[20-21]。經(jīng)計(jì)算得出,F1、F2、F3中脂肪酸乙酯的總含量分別為187.87、199.29、222.07 mg/L,其中己酸乙酯、2-己烯酸乙酯、5-己烯酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、棕櫚酸乙酯(脂肪氣味)表現(xiàn)最明顯,在F1到F3中均呈逐漸增加的趨勢,F1到F2中呈微量增加,F2到F3中增加較明顯,樣品中真核微生物物種數(shù)量變化同樣呈增加趨勢。浸漬時(shí)間的延長使F3中脂肪酸乙酯含量增加,增強(qiáng)了的葡萄酒中的果香味。

圖1 小芒森F1、F2、F3處理中不同種類香氣物質(zhì)的種類及含量Fig.1 The types and contents of different kinds of aroma compounds in the treatment of F1,F2 and F3

3 結(jié)論與討論

在F1、F2、F3過程中,真核微生物呈逐漸增加趨勢,香氣物質(zhì)總含量總體呈增加趨勢,醇類物質(zhì)由于其揮發(fā)性較強(qiáng),其含量呈先減少后增加趨勢,酯類物質(zhì)較穩(wěn)定呈逐漸增加趨勢,尤其脂肪酸乙酯表現(xiàn)最為明顯,在物理及微生物的作用下F3香氣物質(zhì)總含量最高,因此冷浸漬五天釀造的葡萄酒更加香氣濃郁、具有層次感。本實(shí)驗(yàn)只對(duì)冷浸漬過程中真核微生物豐度變化及小芒森整體香氣物質(zhì)的變化做出了初步探究,微生物是否對(duì)香氣物質(zhì)產(chǎn)生影響以及具體是哪種微生物或是其中哪種酵母(包括釀酒酵母和非釀酒酵母)對(duì)何種香氣物質(zhì)產(chǎn)生影響尚需要研究。