厙 曉,錢 楊,李婭琳,何鵬暉,蔣珍菊,常 偉,龔 麗,饒 瑜

(1.西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,四川成都 610039;2.西華大學(xué)理學(xué)院,四川成都 610039;3.成都產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院有限責(zé)任公司,四川成都 610100;4.通標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司四川分公司,四川成都 610100)

豇豆(VignaunguiculataL.),別名長(zhǎng)豆角、飯豆、裙帶豆等,屬豆科一年生植物。莖有矮性、半蔓性和蔓性三種。豇豆喜溫,主要在夏秋兩季上市,其食用方法很多,泡制是一種最常見(jiàn)的貯藏和食用方式[1]。發(fā)酵豇豆(fermented-cowpea)是我國(guó)傳統(tǒng)特色發(fā)酵食品[2],也是我國(guó)產(chǎn)銷量較高的四川泡菜之一,不僅美味爽口,而且具有解膩開(kāi)胃、促消化等功效[3-4]。無(wú)論是在家庭制作還是工廠生產(chǎn)中,發(fā)酵豇豆都是最易發(fā)生腐敗的泡菜之一,這是由于四川泡菜原料自身攜帶了多種微生物,其中包括易造成泡菜腐敗的微生物[5]。

發(fā)酵豇豆的主要腐敗特征表現(xiàn)有軟腐、產(chǎn)生酸敗腐爛味、“生花”即形成膜醭等[5]。蔬菜軟腐是由于部分微生物具有產(chǎn)植物細(xì)胞壁降解酶(plant cell wall degradation enzymes,PCWDEs)的特性,PCWDEs主要包括淀粉酶、纖維素酶、果膠酶、多聚半乳糖醛酸酶等,這些酶能分解泡菜中的纖維素、果膠、木質(zhì)素等[6-7],從而導(dǎo)致蔬菜質(zhì)地變軟,引起蔬菜軟腐。目前對(duì)新鮮蔬菜中產(chǎn)PCWDEs的微生物報(bào)道較多,且多為真菌,但對(duì)發(fā)酵蔬菜尤其是發(fā)酵豇豆中產(chǎn)PCWDEs的微生物報(bào)道甚少,而這些微生物代謝所產(chǎn)生的PCWDEs是造成蔬菜軟腐的重要因素,也是發(fā)酵蔬菜行業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失的主要原因。

本文選用不同品種的豇豆,用配制的老鹽水發(fā)酵制作發(fā)酵豇豆,研究發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵豇豆的質(zhì)構(gòu)品質(zhì)變化并對(duì)產(chǎn)PCWDEs微生物種類進(jìn)行分析，以期為發(fā)酵蔬菜的生產(chǎn)和貯藏提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豇豆 具體品種見(jiàn)表1,購(gòu)于蔬菜基地;老鹽水活化用的蘿卜、豇豆、大蒜、生姜、花椒等 購(gòu)買于當(dāng)?shù)氐牟耸袌?chǎng);老鹽水 采集于當(dāng)?shù)匾患彝?DNA Marker、Taq DNA連接酶(2.5 U/μL)、dNTPs、DNA提取試劑盒、DNA純化試劑盒 北京天根生化科技有限公司;RNase A 美國(guó)Sigma公司;胰蛋白胨大豆瓊脂(tryptone soy agar,TSA)培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯(tryptone soy broth,TSB)培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基、虎紅瓊脂培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限公司;蛋白酶(protease)鑒別培養(yǎng)基(以TSA培養(yǎng)基為基礎(chǔ),添加1%脫脂牛奶)、淀粉酶(amylase)鑒別培養(yǎng)基(以TSA培養(yǎng)基為基礎(chǔ),添加1%可溶性淀粉)、纖維素酶(cellulase)鑒別培養(yǎng)基(以TSA培養(yǎng)基為基礎(chǔ),添加0.1%羧甲基纖維素,25 mmol/L磷酸鈉,pH7.0)、木聚糖酶(xylanase)鑒別培養(yǎng)基(以TSA培養(yǎng)基為基礎(chǔ),添加1%木聚糖,25 mmol/L磷酸鈉,pH7.0)、果膠酶(pectate lyase)鑒別培養(yǎng)基(以TSA培養(yǎng)基為基礎(chǔ),添加1%多聚半乳糖醛酸(PGA),1%酵母提取物,0.38 μmol/L CaCl2,100 mmol/L Tri-HCl,pH8.5)、聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase)鑒別培養(yǎng)基(以TSA培養(yǎng)基為基礎(chǔ),添加1%多聚半乳糖醛酸(PGA),1%酵母提取物,2.2 mmol/L EDTA,110 mmol/L乙酸鈉,pH5.5) 實(shí)驗(yàn)室自制；其他化學(xué)試劑 均為分析純。

表1 供試豇豆品種來(lái)源及特性Table 1 Sources and characteristics of tested cowpea varieties

TA-XT Plus型質(zhì)構(gòu)儀 英國(guó)Stable Micro Systems公司;Master cycler EP gradient聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀 德國(guó)Eppendorf公司;Gel Doc EQ凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司;DYY-8C電泳儀 北京六一儀器廠;pH S-3C酸度計(jì) 成都世紀(jì)方舟科技有限公司;MULTIFUGE X1R高速冷凍離心機(jī)、900 SERIES超低溫冰箱 賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 老鹽水的活化 用無(wú)菌肖特瓶從當(dāng)?shù)匾患彝ゲ杉消}水1000 mL,置于冰盒中,2 h內(nèi)運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室,備用。將洗凈晾干的蘿卜、豇豆、大蒜、生姜、花椒等裝入30 L的土陶壇至2/3處,加入1000 mL老鹽水,并用含NaCl質(zhì)量濃度60 g/L的冷開(kāi)水補(bǔ)至土陶壇總體積的4/5處,液封,在25 ℃下發(fā)酵7 d,備用。

1.2.2 發(fā)酵豇豆的制作 將不同品種豇豆樣品洗凈、晾干,分別裝入10 L玻璃壇子至2/3處,接入活化后的老鹽水30 mL,再用NaCl質(zhì)量濃度為60 g/L的冷開(kāi)水補(bǔ)至玻璃壇總體積的4/5處,料液比約2∶1。液封,每個(gè)品種三個(gè)平行,在25 ℃下發(fā)酵24 d,每隔4 d取適量豇豆及鹽鹵檢測(cè)。

1.2.3 pH的測(cè)定 在豇豆發(fā)酵過(guò)程中每隔4 d用無(wú)菌移液管在無(wú)菌操作臺(tái)中移取10 mL鹽鹵,用pH計(jì)測(cè)定鹽鹵pH。

1.2.4 微生物計(jì)數(shù) 在不同品種豇豆的發(fā)酵過(guò)程中,每隔4 d取鹽鹵樣品并進(jìn)行總菌、乳酸菌、真菌計(jì)數(shù)。參照GB 4789.2-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》的方法制備樣品稀釋液,選取適當(dāng)?shù)南♂尪韧坎加谂囵B(yǎng)基。TSA培養(yǎng)基用于總菌落計(jì)數(shù),MRS瓊脂培養(yǎng)基用于乳酸菌計(jì)數(shù),虎紅瓊脂培養(yǎng)基用于真菌計(jì)數(shù)。

1.2.5 感官評(píng)價(jià) 在豇豆發(fā)酵過(guò)程中采用綜合評(píng)分法,以泡菜的色澤、香氣、鹽鹵渾濁度、膜醭生長(zhǎng)情況為評(píng)價(jià)指標(biāo),以每個(gè)項(xiàng)目25分制評(píng)定,綜合評(píng)分滿分為100分,通過(guò)30名不同年齡階段的食品專業(yè)人員測(cè)評(píng),測(cè)評(píng)人員的年齡在20～40歲之間,男∶女=2∶3,評(píng)價(jià)方式采用風(fēng)味食品常用的盲評(píng)打分法,統(tǒng)計(jì)平均評(píng)價(jià)分值作為有效數(shù)據(jù),評(píng)分按表2進(jìn)行。

表2 發(fā)酵豇豆感官指標(biāo)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standard of fermented cowpea

1.2.6 質(zhì)構(gòu)的測(cè)定 采用質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行測(cè)定,探頭P/5。測(cè)試程序:測(cè)試前速度2 mm/s,測(cè)試速度3 mm/s,測(cè)試后速度2 mm/s,測(cè)定間隔時(shí)間5 s,壓縮量30%,壓縮力5.0 g,測(cè)定發(fā)酵豇豆的硬度、彈性、咀嚼性。每組試驗(yàn)重復(fù)5次,以平均值表示試驗(yàn)結(jié)果[8]。

1.2.7 產(chǎn)PCWDEs微生物的分離及特性分析 在四種豇豆發(fā)酵的第24 d，從鹽鹵固體培養(yǎng)基中各隨機(jī)挑取30株菌進(jìn)行產(chǎn)PCWDEs檢測(cè),編號(hào)分別為A-1～A-30、B-1～B-30、C-1～C-30、D-1～D-30,分別用6種產(chǎn)酶特性鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)進(jìn)行產(chǎn)PCWDEs檢測(cè)[9],于28 ℃培養(yǎng)24 h后觀察各菌株產(chǎn)PCWDEs情況。判定方法:蛋白酶,可直接觀察透明區(qū)域;聚半乳糖醛酸酶和果膠酶,用4 N鹽酸加在菌落周圍并觀察透明區(qū)域;淀粉酶,用碘液染色并觀察透明區(qū)域;纖維素酶和木聚糖酶,用0.1%剛果紅溶液染色15～30 min,再用1 mol/L NaCl沖洗數(shù)次,觀察菌落周圍透明區(qū)域;若有透明區(qū)域,則表示此菌株產(chǎn)PCWDEs。

1.2.8 產(chǎn)PCWDEs微生物的分子生物學(xué)鑒定 對(duì)產(chǎn)植物細(xì)胞降解酶的單克隆菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。使用蔣云露等[10]研究的快速提取法提取總DNA,1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)提取結(jié)果[11]。以提取的DNA為模板,細(xì)菌以引物Eu27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1490R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)為正向和反向引物;PCR體外擴(kuò)增條件為:95 ℃、5 min;95 ℃、1 min、50 ℃、1 min、72 ℃、2 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃、10 min,進(jìn)行16S rDNA片段擴(kuò)增。真菌以引物ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)為正向和反向引物,其PCR體外擴(kuò)增條件為:94 ℃、1 min;94 ℃、1 min,52 ℃、1 min,72 ℃、1 min,30個(gè)循環(huán);72 ℃、5 min,進(jìn)行18S rDNA片段擴(kuò)增。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收純化,送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序,測(cè)得的序列于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行blast比對(duì),其同源性≥97%時(shí)可認(rèn)為是同一個(gè)屬,同源性≥98%時(shí)可認(rèn)為是同一個(gè)種[7],并通過(guò)Clustal X軟件多重比對(duì)后用MEGA 6.0軟件中的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[5],并對(duì)四種發(fā)酵豇豆中產(chǎn)PCWDEs微生物的種類進(jìn)行分析。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用OriginLab 8.0軟件、MEGA 6.0軟件、Clustal X軟件、SPSS軟件、Excel 2007對(duì)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種豇豆發(fā)酵過(guò)程中的pH變化

以不同品種豇豆為原料進(jìn)行發(fā)酵,在豇豆發(fā)酵過(guò)程中鹽鹵的pH變化有明顯的品種特異性(如圖1所示)。豇豆品種A在發(fā)酵過(guò)程中pH下降最快,第4 d時(shí)pH已達(dá)到4.0;豇豆品種C在發(fā)酵的第8 d時(shí)pH可降至4.7。pH是表征泡菜乳酸發(fā)酵成熟和泡菜腐敗的重要指標(biāo)之一[12]。泡菜中的乳酸發(fā)酵是乳酸菌利用蔬菜中的糖進(jìn)行厭氧發(fā)酵生成乳酸的過(guò)程,因此泡菜的發(fā)酵過(guò)程常伴隨著鹽鹵pH的下降。通常認(rèn)為鹽鹵pH降至4.0左右時(shí),泡菜發(fā)酵成熟[13]。以鹽鹵pH為參照,豇豆品種A發(fā)酵成熟速度最快。

圖1 發(fā)酵過(guò)程中豇豆的pH變化Fig.1 The pH change of cowpea during fermentation

豇豆品種A和C在12～24 d保持pH相對(duì)恒定。豇豆品種B和D在發(fā)酵前8 d pH呈下降趨勢(shì),隨即pH開(kāi)始上升,第24 d時(shí)已回升至pH6.5以上。在泡菜發(fā)酵和儲(chǔ)藏過(guò)程中,鹽鹵pH的回升則是判斷泡菜腐敗的重要標(biāo)志之一[12],這是由于某些微生物可以耐受低pH而生長(zhǎng),消耗以乳酸為主的有機(jī)酸或產(chǎn)PCWDEs造成泡菜腐敗[14]。由此可以看出,豇豆品種B和D在發(fā)酵后期和儲(chǔ)藏過(guò)程中更易發(fā)生腐敗。

2.2 不同品種豇豆發(fā)酵過(guò)程中的微生物變化

鹽鹵pH的變化主要由微生物生長(zhǎng)代謝引起[12]。泡菜發(fā)酵過(guò)程中的微生物主要來(lái)源于蔬菜自身攜帶和所接種老鹽水中的微生物。本研究中所用老鹽水均為同一壇同一批次的老鹽水,因此在發(fā)酵過(guò)程中微生物數(shù)量變化的差異主要源于豇豆品種的不同。

不同品種豇豆發(fā)酵過(guò)程中的微生物群落變化表現(xiàn)出與鹽鹵pH變化一致的品種特異性。如圖2a,豇豆品種A發(fā)酵前期中乳酸菌生長(zhǎng)最快,第4 d時(shí)已高于6.0 lg cfu/mL,第8 d時(shí)乳酸菌和總菌均達(dá)到最高,分別高于7.0、8.0 lg cfu/mL,這與豇豆A發(fā)酵過(guò)程中pH下降最快的結(jié)果相符,豇豆品種A在發(fā)酵過(guò)程中pH與乳酸菌的數(shù)量之間存在極顯著相關(guān)(r=0.888,p<0.01),這說(shuō)明蔬菜在乳酸發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌的生長(zhǎng)與鹽鹵pH的下降相關(guān),這與熊濤等[15]的研究一致。豇豆品種B、C、D發(fā)酵前期乳酸菌生長(zhǎng)速度較品種A慢(圖2),這是這三種品種豇豆發(fā)酵前期鹽鹵pH下降相對(duì)緩慢的主要原因。不同品種的豇豆中還原糖、蛋白質(zhì)、粗纖維等營(yíng)養(yǎng)成分存在顯著差異[16],這是影響發(fā)酵過(guò)程中微生物群落生長(zhǎng)差異的主要因素之一。

圖2 發(fā)酵過(guò)程中豇豆的微生物變化Fig.2 Microbial changes of cowpea during fermentation

發(fā)酵12 d后,品種A發(fā)酵豇豆中總菌和乳酸菌數(shù)量分別下降并隨即趨于平衡,真菌數(shù)量先增加后下降最后在4.5 lg cfu/mL左右波動(dòng)(圖2);豇豆品種B、品種C和品種D中乳酸菌于12 d后開(kāi)始減少,但總菌數(shù)量仍高于7.0 lg cfu/mL;真菌數(shù)量也持續(xù)增長(zhǎng),特別是品種B于15 d時(shí)發(fā)酵豇豆中的真菌數(shù)量可達(dá)到(5.9±0.3) lg cfu/mL,隨后持續(xù)增加,在發(fā)酵20 d時(shí)達(dá)到(7.3±0.4) lg cfu/mL。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程,品種A的pH、微生物數(shù)量變化與一般蔬菜在發(fā)酵過(guò)程的相似,而品種B、C、D在發(fā)酵過(guò)程中pH均未下降至4.0左右,且發(fā)酵后期的真菌數(shù)量明顯高于品種A的,這可能與豇豆的品種有關(guān)。

2.3 不同品種豇豆發(fā)酵過(guò)程中的感官評(píng)價(jià)分析

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,部分發(fā)酵豇豆在發(fā)酵第12 d開(kāi)始出現(xiàn)腐敗膜醭,到第24 d時(shí),發(fā)酵結(jié)束,由此對(duì)第12、24 d的發(fā)酵豇豆進(jìn)行感官分析,其結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3知,品種A在發(fā)酵第12、24 d時(shí)的感官評(píng)價(jià)得分均最高,發(fā)酵過(guò)程中,其色澤新鮮、鹽鹵清亮,有著較濃的泡菜香氣;品種B最低,在發(fā)酵第12 d時(shí)色澤偏暗沉,鹽鹵表面有連成一片的膜醭,第24 d時(shí)色澤發(fā)黑,鹽鹵渾濁;品種C與品種D在發(fā)酵第12 d時(shí)表現(xiàn)出正常的泡菜的品質(zhì),但在發(fā)酵第24 d時(shí),色澤偏暗沉、出現(xiàn)腐爛味、鹽鹵較渾濁,泡菜品質(zhì)下降,但好于品種B。

2.4 不同品種豇豆發(fā)酵過(guò)程中的質(zhì)構(gòu)分析

分別在發(fā)酵開(kāi)始(第0 d)、部分發(fā)酵豇豆出現(xiàn)腐敗膜醭(第12 d)、發(fā)酵結(jié)束(第24 d)時(shí)取不同品種豇豆樣品,從硬度、咀嚼性和彈性三個(gè)特征參數(shù)來(lái)分析不同豇豆樣品的質(zhì)構(gòu)變化,結(jié)果如圖3。在發(fā)酵第0 d時(shí),不同品種豇豆的硬度、彈性、咀嚼力差異不顯著(p>0.05),品種B的彈性(0.8825)略低于其他三個(gè)品種(0.92左右)。發(fā)酵前12 d,豇豆的硬度、咀嚼力降低很快,其中品種C的硬度下降率為81.97%,品種A、B、C的下降率在60%左右;發(fā)酵第12 d時(shí),4個(gè)品種豇豆的硬度、彈性、咀嚼力差異均不顯著(p>0.05),但硬度和咀嚼力與發(fā)酵第0 d的差異顯著(p<0.05)。在發(fā)酵的12～24 d中,品種B的硬度、彈性、咀嚼力下降率分別為68.97%、48.50%、63.43%,而其余品種豇豆下降率都比品種B小;第24 d時(shí)品種B的彈性與其余三種豇豆有顯著性差異(p<0.05)。由表3知,發(fā)酵第24 d時(shí),品種B表現(xiàn)出的感官品質(zhì)最差,品種A最好;相比于品種C和品種D,品種A的質(zhì)構(gòu)特征更好,這也是品種A在發(fā)酵過(guò)程中鹽鹵清亮、色澤新鮮的重要原因之一。

表3 感官評(píng)價(jià)結(jié)果Table 3 Results of sensory evaluation

圖3 發(fā)酵豇豆質(zhì)構(gòu)測(cè)試結(jié)果Fig.3 Results of texture test of cowpea during fermentation注:誤差線上的a～d表示不同豇豆不同時(shí)間之間的顯著性差異。

蔬菜原料的品種會(huì)影響其發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)。近年來(lái)已有報(bào)道不同品種芥菜、辣椒、蘿卜等在發(fā)酵后表現(xiàn)出不同的風(fēng)味、質(zhì)構(gòu)、亞硝酸鹽等產(chǎn)品品質(zhì)特征[17-18]。陳玲等[19]發(fā)現(xiàn)3種豇豆品種發(fā)酵后的總酸、還原糖和感官品質(zhì)均有差異,周情操[20]以湖北地區(qū)9個(gè)豇豆品種為原料泡制后產(chǎn)品風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)也有較大不同。除不同品種蔬菜自身的差異之外,這些風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)的不同主要受發(fā)酵過(guò)程中微生物的生長(zhǎng)代謝情況影響[21-22]。本研究中品種A豇豆發(fā)酵前期乳酸菌生長(zhǎng)和鹽鹵pH下降速度快,后期微生物數(shù)量降低，pH穩(wěn)定維持在較低水平,并表現(xiàn)出正常的發(fā)酵豇豆風(fēng)味和質(zhì)構(gòu);其他品種豇豆尤其是品種B豇豆在發(fā)酵后期微生物數(shù)量的增加和pH的上升,這三種發(fā)酵豇豆出現(xiàn)不同程度的軟腐,這可能與豇豆的品種以及PCWDEs微生物種類有關(guān)。

2.5 腐敗微生物產(chǎn)PCWDEs微生物種類分析

微生物產(chǎn)PCWDEs是導(dǎo)致蔬菜軟腐的重要原因之一[9],菌株的具體產(chǎn)酶情況見(jiàn)表4。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有45株產(chǎn)PCWDEs,其中品種A中的最少,有6株;品種B中的最多,有19株;品種C、D中分別有11株和9株。品種B中產(chǎn)PCWDEs的微生物及產(chǎn)酶種類最多,而品種A最少;實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)產(chǎn)蛋白酶與淀粉酶的菌株最多,產(chǎn)纖維素酶的最少;部分菌株同時(shí)產(chǎn)多種酶,如菌株B-1同時(shí)產(chǎn)淀粉酶、果膠酶、木聚糖酶。

將表4中的菌株進(jìn)行16S rDNA及18S rDNA鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些菌株分屬于13個(gè)種,10個(gè)屬,進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建,結(jié)果見(jiàn)圖4。對(duì)四種發(fā)酵豇豆中產(chǎn)PCWDEs微生物種類進(jìn)行分析,結(jié)果見(jiàn)表5。

表4 腐敗發(fā)酵豇豆中顯著產(chǎn)酶菌株的篩選結(jié)果Table 4 Screening results of significant enzyme-producing strains in spoiled fermented cowpea

結(jié)合表5和圖4可知,產(chǎn)蛋白酶的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)和產(chǎn)淀粉酶的異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)在4種發(fā)酵豇豆鹽鹵中均可檢測(cè)到。植物乳桿菌是泡菜發(fā)酵中常見(jiàn)的主要乳酸菌[23-24],但近年來(lái)已有研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌可能參與了泡菜腐敗過(guò)程中的乳酸代謝[25-26]。本研究中,植物乳桿菌還可能通過(guò)產(chǎn)蛋白酶破壞發(fā)酵豇豆的質(zhì)構(gòu)。異常威克漢姆酵母是常見(jiàn)的產(chǎn)淀粉酶酵母菌[27],張騰[28]研究發(fā)現(xiàn)食鹽含量4%的泡菜真菌微生物的主要優(yōu)勢(shì)微生物為異常威克漢姆酵母。

圖4 部分細(xì)菌(a)和真菌(b)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建Fig.4 Phylogenetic tree of part of bacteria(a)and fungi(b)

表5 四種發(fā)酵豇豆中產(chǎn)PCWDEs微生物的種類Table 5 Types of PCWDEs-producing microorganisms in four fermented cowpeas

品種B發(fā)酵豇豆中產(chǎn)PCWDEs微生物數(shù)量和種類最多且產(chǎn)酶種類多樣,包括腸桿菌屬(Enterobacter)、弗氏檸檬酸桿菌(C.freundii)、黃褐假單胞菌(P.fulva)、松鼠葡萄球菌(S.sciuri)、成團(tuán)泛生菌(P.agglomerans)、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)和類香味菌(M.odoratimimus)等。腸桿菌是發(fā)酵蔬菜中常見(jiàn)的腐敗菌,Franco等[26]在黃瓜二次發(fā)酵中發(fā)現(xiàn)陰溝腸桿菌,Krishnan等[29]也在番木瓜果實(shí)里發(fā)現(xiàn)產(chǎn)淀粉酶、木聚糖等的腸桿菌。在以白菜為原料的腐敗泡菜中也發(fā)現(xiàn)了陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、弗氏檸檬酸桿、肺炎克雷伯氏菌和成團(tuán)泛生菌等[30]。品種B發(fā)酵豇豆在24 d時(shí)的嚴(yán)重軟腐與其產(chǎn)PCWDEs微生物的種類、數(shù)量多和產(chǎn)酶類型多樣有關(guān)。

僅在品種D發(fā)酵豇豆中發(fā)現(xiàn)解鳥氨酸拉烏爾菌(R.ornithinolytica),Rao等[30]在研究四川泡菜的腐敗過(guò)程中分離得到解鳥氨酸拉烏爾菌,Zogaj等[31]在研究人體腸道細(xì)菌時(shí)發(fā)現(xiàn)解鳥氨酸拉烏爾菌產(chǎn)纖維素酶。由表3知,豇豆品種C、品種D和品種A中的產(chǎn)PCWDEs微生物種類和數(shù)量相差不大,但品種C和品種D中的微生物產(chǎn)PCWDEs的種類更豐富,從質(zhì)構(gòu)分析結(jié)果中也得出品種C、品種D的質(zhì)構(gòu)品質(zhì)(圖3)好于品種B但又差于品種A。由此可見(jiàn),發(fā)酵后期豇豆的軟腐與產(chǎn)PCWDEs微生物的種類和數(shù)量有關(guān)。

3 結(jié)論

不同品種豇豆在發(fā)酵過(guò)程中的pH、微生物群落及質(zhì)構(gòu)品質(zhì)變化均有差異。在24 d的發(fā)酵過(guò)程中,豇豆品種A發(fā)酵前期乳酸菌生長(zhǎng)和pH下降最迅速,發(fā)酵后期微生物群落和鹽鹵pH穩(wěn)定,且色澤新鮮、鹽鹵清亮,逐漸形成較濃的泡菜香氣,表現(xiàn)出較好的質(zhì)構(gòu)品質(zhì)。豇豆品種B、品種C和品種D發(fā)酵前期乳酸菌生長(zhǎng)以及pH下降速度較品種A慢,發(fā)酵后期,pH開(kāi)始回升,總菌和真菌數(shù)量持續(xù)升高;品種B相比于品種A、品種C、品種D的硬度、彈性、咀嚼力降低得最快且最低,且在發(fā)酵第12 d時(shí)表現(xiàn)出顏色暗沉、鹽鹵表面有較厚膜醭出現(xiàn)等感官特征,其所表現(xiàn)出的質(zhì)構(gòu)品質(zhì)也較差。

將不同品種發(fā)酵豇豆中產(chǎn)PCWDEs微生物分離鑒定后發(fā)現(xiàn),品種B產(chǎn)PCWDEs微生物的種類最豐富且數(shù)量最多。發(fā)酵過(guò)程中,四種不同品種的豇豆中均發(fā)現(xiàn)產(chǎn)蛋白酶的植物乳桿菌和產(chǎn)淀粉酶的異常威克漢姆酵母產(chǎn)PCWDEs;此外在品種A、品種B和品種C中均檢測(cè)到腸桿菌屬產(chǎn)PCWDEs,如E.cloacae、E.aerogenes、E.faecium等;僅在品種D發(fā)酵豇豆中發(fā)現(xiàn)R.ornithinolytica產(chǎn)PCWDEs。結(jié)果表明發(fā)酵后期豇豆的軟腐與產(chǎn)PCWDEs微生物的種類和數(shù)量有關(guān)。