張懿翔,曲勤鳳,余順吉,胡雪蓮,熊 薇,葛 宇

(上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院,上海 200233)

食品過敏原是指能對特定人群產(chǎn)生免疫反應(yīng)或者過敏反應(yīng)的蛋白質(zhì)和其他相關(guān)物質(zhì)。食品過敏屬于機(jī)體對外源物質(zhì)產(chǎn)生的一種變態(tài)反應(yīng)[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì),全球約有1%的成人和2.5%的兒童患有食物過敏癥,每年因此造成150人以上的死亡以及超過2萬人次的急救處理[2]。在發(fā)達(dá)國家約有6%的兒童和3%～4%的成年人被這種免疫介導(dǎo)性疾病所困擾[3-4]。食物過敏已被世界衛(wèi)生組織列為21世紀(jì)重點(diǎn)防控疾病之一[5]。目前大約有160多種食品含有可以導(dǎo)致過敏反應(yīng)的食品過敏原。尤其是對海產(chǎn)品成分過敏現(xiàn)象較為嚴(yán)重。近年來對于海產(chǎn)品過敏原的研究也日益增加,黃榕芳等[6]、伍慧妍等[7]、劉志剛等[8]發(fā)現(xiàn)海產(chǎn)品中軟體類動物主要的過敏原是蛋白原肌球蛋白,曹際娟等[9]建立了對蝦源性成分的PCR方法,沈海旺等[10]對甲殼類食品過敏原三維結(jié)構(gòu)的研究,獲得4種過敏原分子特征抗原表位及部分三維結(jié)構(gòu)。牡蠣屬于歐盟法規(guī)中食品過敏原的種類14個種類中的軟體動物。目前對于甲殼類動物與軟體動物之間具有交叉過敏原[11-13]的情況有一定報(bào)道,然而關(guān)于牡蠣過敏原的相關(guān)報(bào)道卻較少。

牡蠣是常見的世界性的貝類,屬于軟體動物。在我國及世界其他國家都是一種營養(yǎng)價(jià)值很高的珍貴海產(chǎn)品,目前已發(fā)現(xiàn)有100多種,全世界瀕海各國幾乎都有存在[14]。牡蠣不僅是重要的食材,而且具有較高的藥用價(jià)值,但同時(shí)牡蠣又可引起各種過敏反應(yīng)癥狀,其食用安全性令人擔(dān)憂,隨著牡蠣相關(guān)保健品及其他產(chǎn)品的不斷開發(fā),對于牡蠣成分檢測的需求也在提高。目前基于牡蠣線粒體基因分析的一些研究[15-16],雖然能夠檢測出牡蠣樣品,但是其特異性不足,不能區(qū)分出相類似的樣品(扇貝、蛤蜊等)。

針對上述問題,本研究旨在建立一種靈敏度高且特異性強(qiáng)的食品過敏原牡蠣成分的檢測方法,以期能夠快速有效的對牡蠣相關(guān)產(chǎn)品進(jìn)行檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海外牡蠣(澳洲、愛爾蘭、法國、加拿大、丹麥) 上海市出入境檢疫局;國產(chǎn)牡蠣(山東青島、山東乳山、福建、浙江、海南等) 來自實(shí)驗(yàn)室收集樣品;蛤蜊、扇貝、鮑魚、靑魚、蝦、豬肉、牛肉、羊肉、牦牛肉、雞肉、鴨肉、貓肉、大豆、玉米、大米、黃瓜、番茄、狗肉、蝸牛等陰性樣品 為本實(shí)驗(yàn)室收集樣品;海蠣干、海蠔罐頭、耗油、蠔汁等牡蠣類產(chǎn)品 收集于市場或超市;SYBR Green I PCR擴(kuò)增試劑2×SYBR? Premix Ex TaqTM(2X) ,貨號RR420L 寶生物(大連)有限公司;商業(yè)化DNA提取試劑盒High Pure PCR Template Preparation Kit 瑞士Roche公司;十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)提取液(54.9 mmol/L CTAB、1.4 mol/L NaCl、0.1 mol/L Tris-HCl、0.02 mol/L 乙二胺四乙酸(EDTA),pH8.0) 實(shí)驗(yàn)室自制。

Veriti 96 Well Thermal Cycler PCR儀;7500/7500 Fast Real Time PCR System實(shí)時(shí)熒光PCR儀 美國ABI公司;DYY-6C型電泳儀 北京六一儀器廠;UNIVERSAL HOOD II 凝膠成像儀 美國BIO-RAD公司;微量紫外分析儀DS-11 美國DeNovix公司;冷凍離心機(jī) Centrifuge 5810R 德國Eppendorf公司;FreeZone 4.5 Plus冷凍干燥儀 美國Labconco公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人工污染模擬樣品 使用冷凍干燥儀將粉碎好的牛肉和牡蠣肉干燥再磨成粉末狀,并于80 ℃烘干6 h。以牛肉為主要基質(zhì)與其他樣品配成牡蠣含量為10%、1%、0.1%的模擬樣品。

1.2.2 樣品DNA的提取 150 mg左右的樣品中加入1 mL CTAB提取液(20 g/L CTAB,1.4 mol/L NaCl,0.1 mol/L Tris-HCl,0.02 mol/L Na2EDTA,pH8.0)和20 μL蛋白酶K溶液(20 mg/mL),56 ℃振蕩2 h(或者過夜),13000×g離心5 min,轉(zhuǎn)移上清液800 μL到新的離心管中,加入與上清液等體積的酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)混合液用力振蕩混合后,13000×g離心10 min,將上清液600 μL轉(zhuǎn)移到新的離心管中,再次加入與上清液等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)溶液,用力振蕩混合后,13000×g離心10 min,將上清液400 μL轉(zhuǎn)移到新的離心管中,加入2倍體積的預(yù)冷的無水乙醇溶液,混合均勻后室溫放置20 min,13000×g(離心2 min,棄去上清液,加入1 mL 70%乙醇溶液洗滌沉淀2次,倒去乙醇溶液,晾干后加入200 μL TE溶液(1 mmol/L Tris-HCl,0.1 mmol/L Na2EDTA,pH8.0)溶解。DNA提取完成后,用微量紫外分析儀測定DNA濃度,所提取的樣品的DNA溶液均稀釋到工作濃度(約100 ng/μL)。對于一些含量較低的樣品與深加工樣品使用High Pure PCR Template Preparation Kit Roche試劑盒進(jìn)一步純化。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)及篩選 引物設(shè)計(jì):線粒體DNA標(biāo)記,由于其基因分布的普遍性、序列和結(jié)構(gòu)的相對保守性而被廣泛應(yīng)用于分子系統(tǒng)研究及種的鑒定等方面。利用DNASTAR軟件針對牡蠣DNA中序列高度保守的三段基因序列,牡蠣線粒體DNA基因序列(AF177226.1)、細(xì)胞色素c氧化酶亞基1(COI)基因序列(AF300616.1)、牡蠣16Sr RNA基因序列(AY510450)設(shè)計(jì)10對引物,引物均由上海英濰捷基合成。

引物篩選:通過對牡蠣陽性樣品擴(kuò)增效果確定各個引物的最佳退火溫度、初步篩選引物;選取擴(kuò)增特異性最強(qiáng)、擴(kuò)增效果與熔解曲線最適宜的引物,獲得下列最佳引物。

AD-3(5′-3′):TGGGGCTTAGTTTGATAGTAG GTA,AD-4(5′-3′):TAGCTCCAGGGTTATAAAGTC TCC,365 bp。

1.2.4 PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化 以牡蠣(樣品)DNA為模板,使用篩選出的最佳引物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

普通PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件:DNA模板1 μL,2×Mix 10 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,用無菌水補(bǔ)至總體積為20 μL。擴(kuò)增條件為:94 ℃,3 min;94 ℃,30 s,48 ℃,30 s,72 ℃,30 s,35個循環(huán);72 ℃,7 min。取5 μL PCR產(chǎn)物,加1 μL 6X上樣緩沖液點(diǎn)樣進(jìn)行電泳。PCR電泳檢測所用的凝膠濃度為2.0%。陰性對照為不含牡蠣成分的樣品,空白對照為無菌水。

SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件:SYBR Premix Ex TaqTM2×10 μL,PCR上游引物(5 μmol/L)0.5 μL,PCR下游引物(5 μmol/L)0.5 μL,DNA模板1 μL,用滅菌蒸餾水補(bǔ)足20 μL的總反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)程序(參照熒光SYBR Green I PCR擴(kuò)增試劑的說明進(jìn)行調(diào)整):預(yù)變性,95 ℃,30 s,循環(huán)數(shù)1;PCR反應(yīng),第一步,95 ℃變性5 s;第二步,65 ℃退火延伸34 s,同時(shí)在退火過程中收集熒光信號,共進(jìn)行40個循環(huán);熔解曲線分析:95 ℃,15 s;60 ℃,1 min;95 ℃,15 s。退火溫度摸索范圍為61～68 ℃。

1.2.5 PCR產(chǎn)物的測序驗(yàn)證 對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序,然后于NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi. nlm. nih.gov/)上進(jìn)行BLAST,與牡蠣相關(guān)序列進(jìn)行對比。

1.2.6 PCR檢測靈敏度實(shí)驗(yàn) 用微量紫外分析儀測定通過提取得到的樣品DNA濃度,用無菌去離子水將DNA溶液稀釋成質(zhì)量濃度分別為100、50、3.125、0.78、0.2、0.1、0.05、0.025、0.01 ng/μL的溶液,分別取1 μL進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增以及熒光PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系同1.2.4,同時(shí)將牡蠣含量為10%、1%、0.1%的人工模擬污染樣品提取DNA用于靈敏度實(shí)驗(yàn)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

普通PCR結(jié)果通過電泳圖譜分析,SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光PCR的結(jié)果通過ABI 7500自帶的曲線分析功能與Ct值數(shù)據(jù)確認(rèn)牡蠣的特異峰與Tm溫度。每個樣品取至少雙平行復(fù)孔,重復(fù)10次實(shí)驗(yàn)。TM溫度通過各個陽性樣品的平均值得出。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選PCR檢測

分別對利用十對設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,根據(jù)特異性等條件篩選如圖1。有6對引物能夠成功擴(kuò)增,于是又對上述引物進(jìn)行SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光PCR實(shí)驗(yàn),只有AD-3,AD-4為上下游引物具有明顯的擴(kuò)增曲線與熔解曲線。

圖1 PCR引物篩選Fig.1 Screening results of PCR primers 注:1～22:分別為設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增結(jié)果;其中19、20為最終選擇引物AD3、AD4的擴(kuò)增結(jié)果。

最終選擇引物AD-3,AD-4為最佳上下游引物,分別對十種牡蠣陽性樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果如圖2所示,可以看出該引物能夠擴(kuò)增出牡蠣成分,擴(kuò)增產(chǎn)物大小為365 bp。同時(shí)對其他二十余種動植物樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果樣品與空白對照均為陰性如圖3。

圖2 陽性樣品PCR結(jié)果Fig.2 Samples with positive PCR results注:1～10:牡蠣樣品分別來自澳洲、愛爾蘭、法國、加拿大、丹麥、山東青島、山東乳山、福建、浙江、海南;11:陰性對照;12:空白對照。

圖3 陰性樣品PCR結(jié)果Fig.3 Samples with negative PCR results 注:1～3:為陽性對照、陰性對照、空白對照;4～22為牡蠣陰性樣品蛤蜊、扇貝、鮑魚、靑魚、蝦、豬肉、牛肉、羊肉、牦牛肉、雞肉、鴨肉、貓肉、大豆、玉米、大米、黃瓜、番茄、狗肉、蝸牛。

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果的測序驗(yàn)證

通過對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序,將其結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST,結(jié)果顯示與AF177226.1同源性達(dá)到了99%,如圖4,同時(shí)與KJ855245.1、EU672831.1等牡蠣線粒體序列的同源性也達(dá)到了99%。

圖4 測序產(chǎn)物BLAST結(jié)果Fig.4 Results of BLAST sequencing products

2.3 SYBR Green I熒光PCR結(jié)果分析

本實(shí)驗(yàn)分別對所收集樣品進(jìn)行SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光PCR檢測,獲得了S型擴(kuò)增曲線,得到PCR儀分析出的從基線到指數(shù)增長的拐點(diǎn)所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)Ct值,結(jié)合熔解曲線與其對應(yīng)的熔解溫度(Tm)分析得到的特征峰(見圖5),平均Tm值通過對各個樣品收集數(shù)據(jù)計(jì)算出為80.08 ℃平均Ct值為19.40(見表1),所有牡蠣樣品的Ct值和Tm值與陽性對照相符,由此通過基于SYBR Green I的熔解曲線分析熒光PCR方法可以快速的檢測牡蠣成分。在實(shí)驗(yàn)過程中初步退火溫度選擇為60 ℃時(shí),陰性樣品中蛤蜊樣品與扇貝樣品出現(xiàn)了非特異性擴(kuò)增。在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中,分別選擇61～68 ℃作為退火溫度進(jìn)行實(shí)驗(yàn),當(dāng)退火溫度為63 ℃時(shí),蛤蜊的Ct值在35左右,扇貝的Ct值在38左右,從熔解曲線分析可知牡蠣樣品的特征峰值更高,而蛤蜊、扇貝等樣品的特征峰偏低并且Tm值較牡蠣低。隨著退火溫度的升高(61～64 ℃)蛤蜊、扇貝樣品的Ct值、Tm值下降但仍存在一部分非特異性擴(kuò)增的情況,當(dāng)退火溫度提升至65 ℃時(shí),基本能消除非特異性擴(kuò)增,陰性樣品均無S型擴(kuò)增曲線出現(xiàn),并且無特征峰和相應(yīng)的Tm值(見圖6),而退火溫度提升至68 ℃時(shí),雖然非特異性擴(kuò)增被完全消除,但陽性樣品的擴(kuò)增也會受到一定抑制(見表2)。

圖6 蛤蜊、扇貝、牡蠣陽性樣品的熔解曲線、擴(kuò)增曲線比較Fig.6 Comparison of dissolution curves and amplification curves for positive samples of clams,scallops and oysters注:a. 60 ℃退火熔解曲線;b. 60 ℃退火擴(kuò)增曲線;c. 65 ℃退火熔解曲線;d. 65 ℃退火擴(kuò)增曲線。

表1 牡蠣樣品平均Tm值Table 1 Average Tm of oyster samples

表2 不同退火溫度下樣品Tm值Table 2 Tm of samples at different annealing temperatures

圖5 牡蠣陽性樣品的SYBR Green I熔解曲線Fig.5 Dissolution curves of SYBR Green Ifor positive oyster samples

2.4 牡蠣成分的PCR檢測靈敏度

分別取1 μL濃度為100、50、12.5、3.125、0.78、0.2、0.1、0.05、0.025、0.01 ng/μL的樣品DNA溶液進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增以及SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。在檢測中,普通PCR的電泳結(jié)果表明,可以明確檢測出濃度為0.05 ng/μL的樣品(見圖7),當(dāng)樣品DNA濃度的進(jìn)一步降低的情況下,電泳條帶變得不明顯,而同樣的濃度使用熒光PCR時(shí),則均出現(xiàn)擴(kuò)增曲線,Ct值隨著濃度的降低依次遞減(見圖8、表3),均出現(xiàn)熔解曲線的特征峰,可以檢測出0.01 ng/μL濃度的陽性樣品。對于人工模擬污染樣品使用SYBR Green I方法檢測,結(jié)果如圖9,10%、1%、0.1%的樣品均出現(xiàn)擴(kuò)增曲線,且Ct值與Tm值符合預(yù)期,表明該方法能夠在其他基質(zhì)混合的樣品中檢測到牡蠣含量為0.1%的樣品。

圖9 人工污染模擬樣品牡蠣成分熒光PCRFig.9 Real-time PCR for low concentration oyster samples注:從左到右牡蠣濃度依次為陽性樣品、10%、1%、0.1%牡蠣含量樣品。

圖8 牡蠣成分熒光PCR檢測靈敏度Fig.8 Detection sensitivity of real-time PCR sensitivity for oyster samples注:從左到右牡蠣濃度依次為100、50、12.5、3.125、0.78、0.2、0.1、0.05、0.025、0.01 ng/μL。

圖7 牡蠣成分普通PCR檢測靈敏度Fig.7 Detection sensitivity of normal PCR for oyster samples注:1～10:牡蠣濃度分別為100、50、12.5、3.125、0.78、0.2、0.1、0.05、0.025、0.01 ng/μL;11:陰性對照;12:空白對照。

表3 檢測靈敏度Ct值Table 3 Ct of detection sensitivity

結(jié)果表明普通PCR的方法能夠滿足一般樣品的檢測,可作為結(jié)果確認(rèn)的一種方法。而SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光PCR的檢測檢出限更低,具有更高的靈敏度,通過熔解曲線可以排除一些非特異性擴(kuò)增,能夠滿足更低濃度人工模擬污染樣品的檢測,所以選擇此方法進(jìn)一步對牡蠣相關(guān)產(chǎn)品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

在分析樣品是否陽性時(shí),要結(jié)合Ct值與熔解曲線進(jìn)行判定,當(dāng)Ct值小于35時(shí)且具有特異的Tm值時(shí),樣品牡蠣成分為陽性;當(dāng)Ct值小于35,而無特異的Tm值時(shí),應(yīng)重復(fù)檢測進(jìn)行確證;當(dāng)Ct值大于35,且無特異的Tm值時(shí),樣品牡蠣成分為陰性。

2.5 不同牡蠣產(chǎn)品的檢測

運(yùn)用建立的熔解曲線方法對市場收集的海蠣干、海蠔罐頭、蠔油、蠔汁、牡蠣粉等樣品進(jìn)行檢測,樣品類型和檢測結(jié)果見(見表4、表5),實(shí)驗(yàn)中幾種即食產(chǎn)品(牡蠣干、牡蠣罐頭)的Ct值<35且熔解曲線Tm值與牡蠣陽性樣品相符((80.08±0.4) ℃),通過電泳驗(yàn)證也證實(shí)含有牡蠣成分;在牡蠣類保健品中,牡蠣粉都能檢測出牡蠣成分,而部分膠囊和藥片(成分為牡蠣提取物)的產(chǎn)品未能檢測出牡蠣成分。對于深加工食品的檢測效果,部分蠔油中檢測到了信號微弱的牡蠣特異峰,然而樣品中的Ct值與Tm值均不能同時(shí)符合陽性標(biāo)準(zhǔn),因此未檢測出牡蠣源性成分。

表4 牡蠣制品檢測結(jié)果Table 4 Test results of oyster products

表5 牡蠣制品檢測Ct、Tm值Table 5 Ct and Tm results of oyster products

3 結(jié)論

本試驗(yàn)利用普通PCR和SYBR Green I熒光PCR的方法進(jìn)行分析檢測牡蠣成分,普通PCR的方法陽性樣品與陰性樣品的電泳結(jié)果以及測序結(jié)果均與預(yù)期相符,而熒光PCR的檢出限達(dá)到了0.01 ng/μL,同時(shí)適用于低濃度樣品的檢測,能夠檢測出牡蠣成分含量為0.1%的樣品。通過結(jié)合Ct值與熔解曲線的特征峰Tm值分析,SYBR Green I熒光PCR的方法能更快的分析得到結(jié)果,不僅操作安全方便,檢測方法特異性高,而且可以降低檢測成本。針對容易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增的樣品(蛤蜊、扇貝)等樣品進(jìn)行檢測,通過調(diào)整退火溫度后,也具有良好的效果。

通過對牡蠣干、牡蠣粉等牡蠣食品及相關(guān)產(chǎn)品的檢測,證明這本方法可以快速檢測出過敏原牡蠣成分,其中對于收集到的食品相關(guān)產(chǎn)品以及保健品中牡蠣粉的檢出率為100%。而對于深加工產(chǎn)品(如耗油、蠔汁)的檢測中,可能影響結(jié)果的原因有:不同的蠔產(chǎn)品前處理方式不同,而且深加工樣品DNA在加工過程中破壞較為嚴(yán)重導(dǎo)致提取出的DNA質(zhì)量不高。樣品在加工過程中添加的各類高鹽、高滲類輔料對PCR反應(yīng)產(chǎn)生抑制。樣品中牡蠣成分添加量較低或未添加。由此造成提取DNA比較困難,得到的DNA質(zhì)量也比較差,導(dǎo)致不能檢測出牡蠣源性成分。在今后的實(shí)驗(yàn)研究中一方面需要對深加工樣品進(jìn)行前處理的優(yōu)化,另一方面初步建立了探針和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增Lamp技術(shù)的方法進(jìn)行比較檢測,Lamp方法試驗(yàn)條件簡單,更適合于現(xiàn)場在線檢測。