王 穎,李 欣,李 錚,朱 杰,張社奇,張德權(quán),*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室,北京 100193;2.西北農(nóng)林科技大學(xué)理學(xué)院生物物理研究所,生物力學(xué)與工程研究室,陜西楊凌 712100)

評價肉類品質(zhì)的指標(biāo)主要有嫩度、多汁性、風(fēng)味、色澤和系水力等,嫩度是評價肉品質(zhì)的最重要的指標(biāo)之一[1-2]。影響嫩度的因素國內(nèi)外報道很多。研究表明，宰后嫩度和肌肉極限pH有關(guān)。Silva等[3]研究發(fā)現(xiàn)，肌肉極限pH和嫩度呈線性正相關(guān)(r=0.83),然而Purchas等[4]研究發(fā)現(xiàn)肉嫩度和極限pH呈曲線相關(guān)。在2008年,Jeleníková等[5]和Pulford等[6]發(fā)現(xiàn)，高極限pH組和低極限pH組中的肉嫩度比中極限pH組的嫩度高。2014年,Wu等[7]和Lomiwes等[8]研究也得到相同結(jié)論。

宰后肉成熟過程中,嫩度逐漸發(fā)生變化。其主要是由肌原纖維蛋白降解引起的[9]。在肌原纖維蛋白中,肌聯(lián)蛋白是骨骼肌蛋白中分子量最大的蛋白,約為3000 kDa,約占肌原纖維蛋白的10%,且起始于M線,終止于Z線,維系著整個肌小節(jié)完整性和穩(wěn)定性;伴肌動蛋白,起始于Z線至細肌絲蛋白末端,聯(lián)結(jié)著Z線[9-10],肌間線蛋白是聯(lián)結(jié)Z線的中細絲的重要組成部分。以上這些蛋白受肌肉pH影響,且在宰后肌肉成熟過程起著重要的作用[11]。另外,肌鈣蛋白-T為肌細絲蛋白,主要結(jié)合原肌球蛋白,其降解會破壞肌細絲的完整性,改變肌動蛋白和肌球蛋白之間的相互作用,導(dǎo)致肌原纖維的片段化[12]。另外肌原纖維小片化指數(shù)是表征宰后肉嫩度的一個快速指標(biāo)[13-14]。研究表明，高極限pH促進肌聯(lián)蛋白和肌間線蛋白降解[7-8],本研究旨在研究極限pH如何影響其他肌原纖維蛋白降解,進而影響肌原纖維小片化指數(shù)變化。選取50只羊右側(cè)背最長肌為研究對象,按照宰后2 d的pH將肉樣分成三組:高極限pH組(5.72±0.03)、中極限pH組(5.54±0.01)和低極限pH組(5.40±0.02)。不僅研究極限pH對肌聯(lián)蛋白、伴肌動蛋白、肌間線蛋白和肌鈣蛋白-T降解的影響,且分析了以上肌原纖維蛋白和宰后成熟過程中肌原纖維小片化指數(shù)變化的關(guān)系,為宰后肌肉成熟過程中嫩化機理提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大尾寒羊 選取大尾寒羊50只,按照清真屠宰方式屠宰;SYPRO Ruby染色液 美國Invitrogen公司;蛋白酶抑制劑 德國Roch公司;蛋白濃度測定試劑盒 美國Pierce Chemical公司;鼠抗-肌間線蛋白抗體(D1033)、羊抗鼠IgG抗體(A9044) 美國Sigma公司;鼠抗-肌鈣蛋白-T抗體(ab130003) 英國Abcam公司;ECL顯色劑、乙二胺四乙酸(EDTA)、三羥甲基氨基甲烷(Tris Base)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、丙烯酰胺(Acrylamide)、甲叉雙丙烯酰胺(Methylene diacrylamide)、過硫酸銨(APS)和四甲基乙二胺(TEMED) 美國Sigma公司;酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、氯化鈉、硫酸銅、乙醇、乙酸和吐溫-20等 分析純,國藥基團化學(xué)試劑有限公司。

FCR1000-UF-E超純水機 青島富勒姆科技有限公司;ML204/02電子天平 上海梅特勒-托利多有限公司;磁力攪拌器 天津歐諾儀器儀表有限公司;Ultra Turrax Dispersen S25勻漿機 德國IKA公司;Himac CR 22 GII高效冷凍離心機 日本HITACHI公司;SpectraMax 190全波長酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices公司;D37520小型離心機 德國Sigma公司;TS-2型水平脫色搖床 海門市其林貝爾儀器制造有限公司;電泳設(shè)備(Criterion Cell system)、ChemiDocTMMP凝膠成像系統(tǒng)、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜和濕法轉(zhuǎn)膜設(shè)備 美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品分組 本實驗選取50只飼養(yǎng)方式相同8月齡的大尾寒羊,公羊。平均羊胴體重約為(18±1) kg,放置4 ℃,7 d。在宰后1 h、1、2、3、5、7 d時,測定胴體右側(cè)背最長肌pH,隨后留取樣品使用液氮速凍,放置-80 ℃保存。將宰后2 d的pH作為極限pH,按照pH將肉樣分成3組,每組6只羊,即低極限pH組(5.40±0.02),中極限pH組(5.54±0.01)和高極限pH組(5.72±0.03)。

1.2.2 pH測定 使用便攜式自動溫度補償pH計測定每個時間點時宰后肉中的pH。測定pH時,每個樣品在不同地方測定三次。

1.2.3 蛋白提取 肌原纖維蛋白的提取參照高星等[15]的方法:將1 g肌肉組織加入6 mL預(yù)冷的蛋白提取液(100 mmol/L Tris Base,10 mmol/L DTT,pH8.3,蛋白酶抑制劑(50 mL/片))中,用勻漿機進行勻漿(2次,每次30 s),然后離心(10000×g,4 ℃,30 min),得到沉淀(肌原纖維蛋白)。沉淀溶解于5% SDS溶液(60 ℃)后勻漿30 s,80 ℃加熱20 min,即得到肌原纖維蛋白溶液。蛋白濃度使用BCA試劑盒測定。

1.2.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和熒光染色 分離肌聯(lián)蛋白和伴肌動蛋白條帶的聚丙烯酰胺凝膠電泳參考Wang等[16]的實驗方法。肌原纖維蛋白和還原性上樣緩沖液(100 mmol/L)Tris-HCl(pH6.8)、10 mmol/L 二硫蘇糖醇(DTT)、40 g/L SDS、1 g/L溴酚藍、250 g/L甘油)等體積混合后,沸水浴加熱3 min?；旌弦涸?0160×g,離心1 min。上清液(上樣量為30 μg)加入5%的凝膠(甲叉丙烯酰胺∶雙甲叉丙烯酰胺=37.5∶1)進行電泳，(5%分離膠，4%濃縮膠)。電泳時的條件為恒定電流10 mA,約4 h。

電泳后,首先使用固定液(50%(v/v)甲醇,10%(v/v)乙酸)固定兩次,之后水洗三次,使用SYPRO Ruby染液染色避光過夜,兩次脫色(10%乙醇,7%乙酸),每次30 min。水洗三次,每次5 min。使用ChemiDocTMMP凝膠成像儀掃描凝膠。

1.2.5 肌間線蛋白和肌鈣蛋白-T的免疫印跡 肌間線蛋白和肌鈣蛋白-T在宰后過程中的降解情況使用免疫印跡測定,其中方法參考Li等[17]的方法測定。首先,進行SDS-PAGE電泳,肌間線蛋白分離膠為12%,而肌鈣蛋白-T的分離膠為15%,兩者皆為4%的濃縮膠。其中的電泳條件為:濃縮膠70 V,分離膠110 V。電泳后,使用濕法轉(zhuǎn)膜裝置將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。使用TBS(10 mmol/L Tris Base,150 mmol/L NaCl,pH7.5)漂洗膜三次后,用含有3%牛血清白蛋白、0.05%Tween-20的封閉液封閉2 h。之后將使用封閉液稀釋的抗體孵育4 ℃過夜。隨后使用TBST1(含0.1% Tween-20的TBS溶液)漂洗三次后與羊抗鼠IgG抗體(用封閉液1∶2500稀釋)室溫孵育2 h。然后使用TBST2溶液(0.05 mol/L Tris Base,0.15 mol/L NaCl,0.1% Tween-20,pH7.5)漂洗3次,最后使用ECL顯色劑顯色,并使用ChemiDocTMMP凝膠成像儀拍照。

采用Quantity One軟件分析蛋白免疫印跡條帶灰度值。其中肌間線蛋白的抗體為1∶1000的鼠抗-肌間線蛋白抗體和肌鈣蛋白-T的抗體為1∶1000的鼠抗-肌鈣蛋白T抗體。另外電泳過程中的標(biāo)準(zhǔn)樣品為高極限pH組宰后1 h的肌原纖維蛋白樣品。

1.2.6 肌原纖維小片化指數(shù)(MFI) 參考Rajagopal等[18]的方法測定羊肉宰后成熟過程中肌原纖維小片化指數(shù),其中操作過程稍作修改。約0.5 g的肌肉加入5 mL的預(yù)冷的緩沖液(100 mmol/L KCl,20 mmol/L K2HPO4,1 mmol/L EDTA,1 mmol/L MgCl2,pH7.1),勻漿30 s,兩次,中間間隔1 min。勻漿液離心3000×g,15 min。倒去上清,重懸,離心兩次。之后再使用緩沖液將沉淀重懸,使用雙縮脲法測定蛋白濃度。將蛋白濃度調(diào)成0.5 mg/mL,使用分光度計在540 nm下測度體系的吸光值。肌原纖維小片化指數(shù)為該吸光值乘以200。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 pH、肌原纖維小片化指數(shù)數(shù)據(jù)和肌間線蛋白相對灰度值均采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件處理。其中pH和肌原纖維小片化指數(shù)使用非飽和模型進行多因素方差分析。肌間線蛋白相對灰度值使用單因素方差分析。且兩種分析方法均選擇多重比較檢驗方法,通過最小顯著差異法(Least significant difference,LSD)進行差異顯著性分析。顯著水平為p<0.05,極顯著水平為p<0.01。線性擬合分析使用Excel 2010。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊宰后成熟過程中肌肉pH的變化

宰后成熟過程中三組肌肉pH變化如圖1所示。所有樣品的pH在宰后1 d內(nèi)均極顯著下降(p<0.01)。在高極限pH組和中極限pH組中,肌肉pH在宰后1 d后無顯著變化(p>0.05)。而在低極限pH組中,pH一直下降至宰后5 d。這可能是由于在低極限pH組中的糖原含量較高,糖酵解進程使得乳酸在宰后1 d仍在積累,使宰后pH持續(xù)下降。而低極限pH組宰后7 d的pH顯著高于宰后5 d的pH(p<0.05),這是由于在宰后后期,蛋白質(zhì)被蛋白酶作用會產(chǎn)生多肽、小肽,這些物質(zhì)和脫羧基產(chǎn)生胺類物質(zhì)、脫氨基產(chǎn)生NH3等物質(zhì)。這些分解產(chǎn)物多數(shù)為兩性分子或顯堿性的物質(zhì),對肌肉內(nèi)的pH具有緩沖作用,所以肌肉的pH又能夠有所回升[19]。在宰后2、3、5 d和7 d時,高極限pH組的pH顯著高于中極限pH組的pH,且中極限pH組中的pH顯著高于低極限pH組的pH(p<0.05)。

圖1所示,結(jié)果表明三組肌肉中pH在宰后2 d已達到極限pH,因為宰后2 d的pH與之后的pH相比沒有顯著差異(p>0.05)。該結(jié)果和Bouton等的研究[20]結(jié)果是不一致的。Bouton等發(fā)現(xiàn)羊肉在1～2 ℃保存時,宰后3 d到達極限pH。這是由于本實驗貯存的溫度稍高,糖酵解速率較快,達到極限pH時間較早。另外,高極限pH組的極限pH顯著高于中極限pH中的極限pH,同時中極限pH組的極限pH也顯著高于低極限pH組的極限pH(p<0.05),宰后肌肉成熟過程中,糖酵解產(chǎn)生的乳酸是引起肌肉中pH變化的主要因素,且宰后肌肉的糖原含量決定了肌肉極限pH[20]。在高極限pH組和中極限pH組中的糖原含量也許較低,產(chǎn)生的乳酸含量也相應(yīng)較低,故兩組肌肉中的極限pH較高。

圖1 羊宰后成熟過程中肌肉pH的變化Fig.1 Change of pH in postmortem ovine muscle注:X-Y-Z表示同一時間點不同組的pH差異極顯著(p<0.01);x-y-z表示同一時間點不同組的pH差異顯著(p<0.05);A-B-C表示同一組不同時間點pH差異極顯著(p<0.01);a-b-c表示同一組不同時間點pH差異顯著(p<0.05)。

2.2 極限pH對肌聯(lián)蛋白和伴肌動蛋白降解的影響

在宰后過程中肌原纖維蛋白進行SDS-PAGE電泳,肌聯(lián)蛋白和伴肌動蛋白的蛋白條帶如圖2所示。肌聯(lián)蛋白的降解過程由T1降解為T2。另外宰后7 d內(nèi),高極限pH組、中極限pH組和低極限pH組中肌聯(lián)蛋白降解過程如圖3所示。高極限pH組中的肌聯(lián)蛋白降解較快,即宰后1 d時出現(xiàn)降解條帶T2。而在宰后1 d時,中極限pH組和低極限pH組中并沒有出現(xiàn)降解條帶T2。在中極限pH組中,降解條帶T2 在宰后2 d時出現(xiàn)。而在低極限pH組出現(xiàn)降解條帶的時間點為宰后5 d。這表明肌聯(lián)蛋白在高極限pH組中降解較快,該結(jié)果與Wu等[7]的結(jié)果是一致的。這是由于在高極限pH組中的μ-鈣蛋白酶的活性較高引起的。μ-鈣蛋白酶是鈣蛋白酶體系中的一種酶,它能夠降解大多肌原纖維蛋白,是嫩化肉品、提高肉品嫩度重要的內(nèi)源性蛋白酶[21]。其最適pH接近中性[22-23]。在高極限pH組中,pH接近中性,使得μ-鈣蛋白酶發(fā)生很快自溶,降解為78 kDa的條帶,該降解條帶具有較高的活性,從而加快肌聯(lián)蛋白降解。

圖2 高極限pH組中肌原纖維蛋白宰后7 d內(nèi)SDS-PAGE凝膠電泳分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of myofibrillar proteins degradation within 7 d postmortem from the high pHu group

伴肌動蛋白在宰后7 d內(nèi)的降解情況如圖3所示。中極限pH組中伴肌動蛋白在宰后1 d時開始出現(xiàn)降解條帶,但在高極限pH組和低極限pH組中并沒有出現(xiàn)降解直至宰后2 d伴肌動蛋白開始出現(xiàn)降解現(xiàn)象。該結(jié)果說明伴肌動蛋白在中極限pH組中降解較快。在宰后肉嫩化過程中促進蛋白降解的蛋白酶并非僅僅是鈣蛋白酶系統(tǒng)，這也許是由溶酶體中釋放出的組織蛋白酶引起的。牲畜在宰殺后,由于糖原的分解作用使肌肉內(nèi)產(chǎn)生乳酸,pH會隨之下降。當(dāng)胴體內(nèi)的pH降至5.5時,不僅能減緩鈣激活因子的活性,而且隨著乳酸的增多,還能引起細胞內(nèi)溶酶體破壞。這一變化會導(dǎo)致溶酶體釋放出相當(dāng)數(shù)量的酶,其中有許多組織蛋白酶[24]。該酶可以水解肌原纖維蛋白,且該酶最適pH是偏于酸性[25],接近中極限pH組的pH。這些水解酶在宰后成熟后期中的作用需要進一步的研究。

圖3 高、中和低極限pH組中肌聯(lián)蛋白和伴肌動蛋白宰后7 d的降解情況Fig.3 Titin and nebulin degradation within 7 d postmortem from three groups

2.3 極限pH對肌間線蛋白降解的影響

肌間線蛋白的亞基的分子量約54 kDa,是一種圍繞Z盤分布并延伸到Z盤內(nèi)部,位于Z線以及Z線和肌細胞膜之間的重要的骨架蛋白。其在成熟的肌細胞中,該蛋白在穩(wěn)定肌纖維的橫向結(jié)構(gòu)中起著非常重要的作用[12]。高極限pH組、中極限pH組和低極限pH組中的肌間線蛋白宰后7 d內(nèi)的降解情況如圖4A所示。在圖4A中,高極限pH組中原肌間線蛋白條帶降解較快。在圖4B中,肌間線蛋白相對灰度值在高極限pH組持續(xù)顯著下降至宰后2 d(p<0.05),在中極限pH組中明顯下降至宰后5 d,而在低極限pH組中宰后7 d內(nèi)一直持續(xù)顯著下降(p<0.05)。在宰后1、2、3 d時,高極限pH組中的肌間線蛋白的相對灰度值明顯低于中極限pH組的相對灰度值,且低極限pH中的肌間線蛋白的灰度值最高(p<0.05,圖4B)。這是由于肌間線蛋白是μ-鈣蛋白酶分解的底物[17],在低極限pH組中,μ-鈣蛋白酶活性較低,原肌間線蛋白降解速率較慢,使肌間線蛋白的相對灰度值明顯較高。

圖4 高極限pH組、中極限pH組和低極限pH組中肌間線蛋白在宰后7 d內(nèi)免疫印跡Fig.4 Immunoblot of desmin within 7 dpostmortem from three groups注:肌間線蛋白降解條帶分別是38 kDa和35 kDa;ST為標(biāo)準(zhǔn)樣品,即高極限pH組宰后1 h的肌原纖維蛋白樣品;x-y-z表示同一時間點不同組的肌間線蛋白相對灰度值差異顯著(p<0.05),a-b-c表示同一組不同時間點肌間線蛋白相對灰度值差異顯著(p<0.05)。

2.4 極限pH對肌鈣蛋白-T降解的影響

肌鈣蛋白-T是一種分子量約35 kDa的重要調(diào)節(jié)蛋白,該蛋白降解成分子量為28～30 kDa小分子。大量實驗表明該蛋白和肉的嫩度密切相關(guān)[26],可作為肉嫩度改善的一個標(biāo)志[12]。高極限pH組、中極限pH組和低極限pH組中的肌鈣蛋白-T在宰后過程中的降解過程如圖5所示。在宰后1 d時,高極限pH組已明顯出現(xiàn)降解條帶。中極限pH組的肌鈣蛋白在宰后1 d時也開始出現(xiàn)降解條帶,但降解條帶模糊。低極限pH組中,在宰后1 d時沒有出現(xiàn)降解條帶,在宰后2 d才開始發(fā)生降解。免疫印跡結(jié)果表明，肌鈣蛋白-T在高極限pH組中降解較快。分析原因為肌鈣蛋白-T屬于肌原纖維蛋白,是μ-鈣蛋白酶降解的底物,當(dāng)μ-鈣蛋白酶活性受到抑制時,該蛋白降解速率減慢[27-28]。而在Lomiwes等[11]研究中高極限pH組中的μ-鈣蛋白酶活性較高,肌鈣蛋白-T在高極限pH組降解較快。

圖5 高極限pH組、中極限pH組和低極限pH組中肌鈣蛋白-T在宰后7 d內(nèi)的降解情況Fig.5 Immunoblot of troponin-T within 7 d postmortem from three groups注:標(biāo)準(zhǔn)樣品為高極限pH組宰后1 h的樣品。

2.5 肌原纖維小片化指數(shù)(MFI)

高極限pH組、中極限pH組和低極限pH組中肌原纖維小片化指數(shù)在宰后7 d內(nèi)的變化情況如圖6A所示。在宰后1 d內(nèi),高極限pH組中的肌原纖維小片化指數(shù)迅速顯著增高(p<0.05),之后沒有顯著變化(p>0.05)。在中極限pH組中,宰后3 d內(nèi)肌原纖維小片化指數(shù)一直處于上升的趨勢,之后沒有發(fā)生顯著變化(p>0.05)。在低極限pH組中,肌原纖維小片化指數(shù)在宰后7 d內(nèi)緩慢上升。在宰后1、2、3、5、7 d時,高極限pH組和中極限pH組的肌原纖維小片化指數(shù)顯著高于低極限pH組中的肌原纖維小片化指數(shù)(p<0.05)。肌原纖維小片化指數(shù)是表征宰后嫩度的一個快速指標(biāo)[13],本研究結(jié)果表明高極限pH組和中極限pH組的肌肉嫩度高于低極限pH組的嫩度。

另外,對三組中肌原纖維小片化指數(shù)進行線性擬合,如圖6B所示。高極限pH組中肌原纖維小片化指數(shù)的變化速率(k=6.5057)高于中極限pH組的變化速率(k=5.5598),且中極限pH的變化速率高于低極限pH組的變化率(k=4.3381)。這主要是由高極限pH組和中極限pH組中的肌原纖維蛋白降解較快引起的[29]。高極限pH組中的肌聯(lián)蛋白、肌間線蛋白和肌鈣蛋白-T皆為肌原纖維蛋白中的關(guān)鍵蛋白,且為μ-鈣蛋白酶的降解底物。當(dāng)μ-鈣蛋白酶活性較高時,則這些蛋白降解迅速。另外,中極限pH組中的伴肌動蛋白降解較快,故高極限pH組中和中極限pH組中的MFI明顯高于低極限pH組的MFI,且變化速率較快。

圖6 高極限pH組、中極限pH組和低極限pH組中肌原纖維小片化指數(shù)宰后7 d的變化情況Fig.6 Change of myofibril fragmentation index(MFI) within 7 d postmortem from three groups注:x-y-z表示同一時間點不同組的肌原纖維小片化指數(shù)差異極顯著(p<0.05),a-b-c表示同一組不同時間點肌原纖維小片化指數(shù)差異顯著(p<0.05);A:肌原纖維小片化指數(shù)；B：肌原纖維小片化指數(shù)線性擬合圖。

3 結(jié)論

在宰后肌肉成熟過程中,肌聯(lián)蛋白、肌間線蛋白、肌鈣蛋白-T在高極限pH組中降解較快,而伴肌動蛋白在中極限pH組中降解較快。此結(jié)果表明，μ-鈣蛋白酶對肌聯(lián)蛋白、肌間線蛋白和肌鈣蛋白-T的降解引起肌原纖維的片段化,促進宰后前期肌肉嫩化進程。而伴肌動蛋白或許是由于剩余的μ-鈣蛋白酶和組織蛋白酶降解來促進了宰后后期的嫩化進程的。本研究不僅為高極限pH組嫩度較高提供了依據(jù),而且為宰后肉嫩度形成機理提供理論基礎(chǔ)。另外本研究對有關(guān)組織蛋白酶的研究欠缺,需進一步研究組織蛋白酶對肌原纖維蛋白降解機理，進而揭示該酶在宰后成熟過程中的重要作用。