吳月國，趙錚蓉，張萍，趙菊潤，劉驊，*

（1.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，浙江杭州310013；2.龍陵縣石斛研究所，云南保山678300）

紫皮石斛為蘭科植物齒瓣石斛（Dendrobium devonianum Paxton.）的干燥莖，又名齒瓣石斛，收載于《云南省中藥材標準》，具有益胃生津，滋陰清熱等功效[1]，為我國西南各省區(qū)主要習(xí)用品種之一，石斛中的佳品[2-4]。近期，云南省衛(wèi)計委發(fā)布了紫皮石斛的食品安全地方標準，現(xiàn)已屬于藥食兩用管理的石斛品種。作為迄今唯一由行政主管部門發(fā)布食品安全標準的石斛品種，紫皮石斛無疑將步入發(fā)展的快車道。西洋參（Panax quinquefolium L.）具有補氣養(yǎng)陰，清熱生津等功效[5-6]，收錄于衛(wèi)生部發(fā)布的保健食品可用目錄。紫皮石斛西洋參顆粒是以紫皮石斛復(fù)配西洋參，經(jīng)現(xiàn)代先進工藝制成的顆粒劑，是擬以紫皮石斛為主要原料打造的高原特色產(chǎn)品。本研究考察了紫皮石斛西洋參顆粒的主要生產(chǎn)制備工藝，并評價其增強免疫力的保健功能，以期進一步的開發(fā)利用。

1 試驗材料

無水葡萄糖、人參皂苷Re：中國食品藥品檢定研究院；苯酚：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；濃硫酸：西隴化工股份有限公司；香草醛：上海雙喜香料助劑有限公司；乙酸：杭州化學(xué)試劑有限公司；高氯酸：金鹿化工有限公司；乙醇：上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；RPMI1640培養(yǎng)液：美國GIBCO公司；刀豆蛋白A：上海源葉生物科技服務(wù)有限公司；印度墨汁：南京都萊生物技術(shù)有限公司；綿羊血：金華利民試劑經(jīng)營部；YAC-1細胞：中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所。

T6新世紀分光光度計：北京普析通用儀器責(zé)任有限公司；MAX190型紫外可見連續(xù)光譜酶標儀：美國分子儀器公司；TD12001型電子天平：余姚市金諾天平儀器有限公司；AG285型電子天平：瑞士METTLER公司；XS205型電子天平：瑞士METTLERTOLEDO公司；DM4000BLED型熒光顯微鏡：德國萊卡公司。

鐵皮石斛：龍陵縣石斛研究所；西洋參：華東醫(yī)藥股份有限公司藥材參茸分公司；ICR小鼠：浙江省實驗動物中心。

2 方法

2.1 紫皮石斛西洋參顆粒制備工藝研究

紫皮石斛西洋參顆粒由紫皮石斛復(fù)配西洋參，經(jīng)提取、濃縮、制粒、干燥等現(xiàn)代工藝精制而成，其中提取工藝步驟對產(chǎn)品質(zhì)量的影響最為關(guān)鍵，需重點考察。根據(jù)紫皮石斛和西洋參有效成分的化學(xué)性質(zhì)，分別通過正交試驗考察用水提取和用乙醇提取對有效成分的影響，優(yōu)選紫皮石斛西洋參顆粒的提取工藝。

多糖是紫皮石斛的主要有效成分之一，具有增強免疫力的功能。多糖易溶于水，宜用水進行提取，影響因素有加水量、煎煮時間、煎煮次數(shù)等，故以加水量A（20倍、30倍、40倍）、煎煮次數(shù) B（1次、2次、3次）、煎煮時間C（3 h、4 h、5 h）為考察的因素和水平按L9（34）正交表進行正交試驗[7-9]，以苯酚-濃硫酸法測粗多糖含量（以無水葡萄糖計）[5，10]，作為評價指標，篩選紫皮石斛的最佳提取工藝。

西洋參富含皂苷，宜采用乙醇回流提取，影響西洋參回流提取的因素有乙醇濃度、乙醇用量、回流時間、回流次數(shù)等，故以乙醇濃度A（30%、50%、70%）、乙醇用量 B（20倍、30倍、40倍）、回流時間 C（1 h、2 h、3 h）及回流次數(shù)D（1次、2次、3次）為考察的因素和水平按L9（34）正交表進行正交試驗[11-12]，以總皂苷含量（以人參皂苷Re計）[13]為評價指標，篩選西洋參的最佳提取工藝。

確定提取工藝后，再參照中藥顆粒劑的制備方法，即濾液先減壓濃縮，濃縮液添加輔料制粒，干燥，整粒后得紫皮石斛西洋參顆粒，以苯酚-濃硫酸法測其粗多糖含量，按照《保健食品技術(shù)評價規(guī)范》2003年版中總皂苷的測定方法測定總皂苷含量。

2.2 紫皮石斛西洋參顆粒增強免疫力功能測定

2.2.1 小鼠分組

ICR 小鼠，SPF 級，均為雌性，體重 18 g～22 g，由浙江省實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙）2016-0010。實驗環(huán)境條件為：室溫20℃～25℃，相對濕度40%～70%。根據(jù)衛(wèi)生部《保健食品技術(shù)評價規(guī)范》[13]和相關(guān)科學(xué)文獻[14-15]設(shè)計試驗。每項實驗小鼠均被分為紫皮石斛西洋參顆粒低、中、高3個劑量組（0.5、1.0、3.0 g/kg）和陰性對照組（蒸餾水），每組10只。試樣灌胃體積為20 mL/kg，每天1次，連續(xù)30 d。

2.2.2 小鼠臟器/體重比值的測定

連續(xù)灌胃給予試樣30 d后，頸椎脫臼法處死小鼠，取其脾臟、胸腺稱重，計算臟器指數(shù)。

2.2.3 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實驗

實驗第26天，每只小鼠腹腔注射0.2 mL 2%壓積綿羊紅細胞（sheep red blood cell，SRBC）懸液，進行免疫。免疫后4 d，測量左后足跖部厚度，然后于測量部位皮下再次注射20 μL20%SRBC懸液，24 h后再次測量左后足跖部厚度，計算攻擊前后足跖的厚度差值。

2.2.4 小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗

灌胃給予試樣30 d后，取脾臟制備單細胞懸液，分2孔加入24孔培養(yǎng)板中，一孔加刀豆蛋白A液，另一孔作為對照。置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)68 h，每孔加RPMI1640培養(yǎng)液和噻唑藍液，再繼續(xù)培養(yǎng)4 h加酸性異丙醇，使紫色結(jié)晶完全溶解。轉(zhuǎn)移至96孔培養(yǎng)板中，570 nm波長處測定OD值。

2.2.5 抗體生成細胞數(shù)檢測

實驗第26天，每只小鼠腹腔注射0.2 mL2%SRBC懸液進行免疫，再灌胃給予試樣4 d后處死動物，取脾制備單細胞懸液，按Jerne改良玻片法[15]進行實驗，計算溶血空斑數(shù)。

2.2.6 血清溶血素的測定

實驗第26天，每鼠腹腔注射0.2 mL 2%SRBC懸液進行免疫。4 d后，摘眼球取血，分離血清，用生理鹽水將血清倍比稀釋，在微量血凝板內(nèi)與SRBC進行血凝實驗，觀察血球凝集程度，計算抗體積數(shù)。

2.2.7 小鼠碳廓清實驗

連續(xù)灌胃給予試樣30 d后，按10 mL/kg體重計算，尾靜脈注射生理鹽水稀釋4倍的印度墨汁。在注射后2、10 min從內(nèi)眥靜脈叢取血20 μL，加入到2 mL 0.1%Na2CO3溶液中，600 nm波長測定OD值，并將小鼠處死，取肝臟、脾臟稱重，計算吞噬指數(shù)。

2.2.8 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗

實驗第26天給每只小鼠腹腔注射0.2 mL 2%SRBC懸液。4 d后，每鼠腹腔注射加小牛血清的Hank's液3mL，處死小鼠，吸取腹腔洗液0.5 mL加入盛有0.5 mL 1%雞血紅細胞懸液的試管內(nèi)，混勻。吸取0.5 mL混合液，加入玻片的瓊脂圈內(nèi)。放置孵箱內(nèi)37℃孵育15 min后固定，Giemsa液染色15 min。沖凈，晾干，鏡檢，計數(shù)，計算吞噬指數(shù)。

2.2.9 NK細胞活性測定

灌胃給予試樣30 d后，取小鼠脾臟制備單細胞懸液，按乳酸脫氫酶測定法[15]進行實驗，在酶標儀490 nm處測定OD值，計算NK細胞活性。

2.2.10 統(tǒng)計學(xué)分析

各組數(shù)據(jù)用x±s表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 紫皮石斛西洋參顆粒工藝優(yōu)選結(jié)果

乙醇提取正交試驗結(jié)果顯示回流提取西洋參總皂苷的影響因素大小順序為：A>B>C>D，即乙醇濃度對提取率的影響最大，乙醇用量次之。根據(jù)試驗結(jié)果，并綜合考慮生產(chǎn)成本和生產(chǎn)效率，最終確定提取條件為：A3B2C3D1，即確定西洋參提取的最佳工藝參數(shù)是：用30倍量70%乙醇回流提取3 h。

水提正交試驗結(jié)果顯示提取紫皮石斛粗多糖的影響因素大小順序為：B>A>C，即煎煮次數(shù)對提取率的影響最大，加水量次之，煎煮時間對其影響相對最小。綜合試驗結(jié)果、生產(chǎn)成本等，最終確定紫皮石斛水提的提取條件為：A2B2C2。因此可以確定紫皮石斛西洋參顆粒水提的工藝參數(shù)是：30倍量水，提取2次，每次4 h。

最終根據(jù)制備工藝試驗結(jié)果，確定紫皮石斛西洋參顆粒的的生產(chǎn)工藝為：西洋參先用30倍量70%乙醇回流提取3 h，濾渣再與紫皮石斛一起加30倍量水，提取2次，每次4 h，濾液經(jīng)減壓濃縮，添加輔料后流化床制粒、干燥。按照該工藝制備的紫皮石斛西洋參顆粒，經(jīng)檢測，粗多糖含量約為3%，總皂苷含量約為0.2%。

3.2 小鼠臟器/體重比值的測定結(jié)果

與對照組相比，紫皮石斛西洋參顆粒的3個劑量組小鼠脾臟/體重比值及胸腺/體重比值的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。小鼠臟器/體重比值的測定結(jié)果見表1。

表1 小鼠臟器/體重比值的測定結(jié)果（x±s）Table 1 Effect of the spleen and thymus index on mice（x±s）

3.3 小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)和脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗結(jié)果

SRBC可刺激T淋巴細胞增殖成致敏淋巴細胞，當(dāng)4 d后再用SRBC攻擊時，攻擊部位會出現(xiàn)腫脹，其腫脹程度可反映遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)程度，在本實驗中，與對照組相比，紫皮石斛西洋參顆粒中、高劑量組均能顯著增加小鼠左后足跖部24 h與0 h的厚度差值（P<0.05），表明細胞免疫功能陽性。如表4所示，用ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細胞增殖實驗中，紫皮石斛西洋參顆粒3個劑量組與對照組比較光密度值的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)和小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗結(jié)果見表2。

表2 小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)和小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗結(jié)果（x±s）Table 2 Effect of the delayed type hypersensitivity（DTH）and the transformation level of lymphoid on mice（x±s）

3.4 小鼠抗體生成細胞和血清溶血素的測定結(jié)果

小鼠抗體生成細胞和血清溶血素測定結(jié)果見表3，可見，與對照組相比，紫皮石斛西洋參顆粒3個劑量組小鼠溶血空斑數(shù)的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。實驗小鼠經(jīng)SRBC免疫后的血清溶血素水平是反映小鼠體液免疫功能的重要指標，在本實驗中，與對照組相比，紫皮石斛西洋參顆粒的3個劑量組都能顯著提高小鼠的抗體積數(shù)值，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），表明紫皮石斛西洋參顆粒能增強小鼠的體液免疫功能。

表3 小鼠抗體生成細胞和血清溶血素測定結(jié)果（x±s）Table 3 Effect of the number of antibody formation cell and the serum emolysin content on mice（x±s）

3.5 小鼠碳廓清實驗結(jié)果

小鼠碳廓清實驗結(jié)果見表4。

表4 小鼠碳廓清實驗結(jié)果（x±s）Table 4 Effect of the carbon clearance index on mice（x±s）

如表4所示，與對照組相比，紫皮石斛西洋參顆粒3個劑量組小鼠的吞噬指數(shù)的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3.6 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的實驗結(jié)果

小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力的實驗結(jié)果見表5。

表5 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力的實驗結(jié)果（x±s）Table 5 Effect of the phagocytic ability of celiac macrophage on mice（x±s）

如表5所示，與對照組相比，各劑量均能有效提高小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的吞噬率和吞噬指數(shù)，其中高劑量組顯著提高（P＜0.01），表明紫皮石斛西洋參顆粒能促進小鼠巨噬細胞吞噬雞紅細胞的能力。

3.7 小鼠NK細胞活性測定結(jié)果

小鼠NK細胞活性測定結(jié)果見表6。

表6 小鼠NK細胞活性測定結(jié)果（x±s）Table 6 Effect of the activity of natural-killer cells（NK）on mice（x±s）

如表6所示，活細胞胞漿內(nèi)的乳酸脫氫酶在正常情況下不能透過細胞膜，但當(dāng)細胞受到NK細胞殺傷后，乳酸脫氫酶會釋放到細胞外，在本實驗中，與對照組相比，紫皮石斛西洋參顆粒低劑量組NK細胞活性得到明顯升高（P＜0.05）。

4 結(jié)論

根據(jù)制備工藝試驗結(jié)果確定了紫皮石斛西洋參顆粒的生產(chǎn)工藝。西洋參先用30倍量70%乙醇回流提取3 h，濾渣再與紫皮石斛一起加30倍量水，提取2次，每次4 h，過濾，濾液再經(jīng)濃縮、制粒、干燥等步驟后可制備得到紫皮石斛西洋參顆粒劑產(chǎn)品。

紫皮石斛西洋參顆粒劑產(chǎn)品經(jīng)增強免疫力功能評價，實驗結(jié)果顯示其能提高小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)水平和血清溶血素含量，增強小鼠吞噬細胞吞噬雞紅細胞的能力，升高NK細胞活性，可判定其具有增強免疫力的保健功能，可進一步開發(fā)應(yīng)用。