劉光富,馬 骉,付賢樹,俞曉平

(中國計量大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 浙江省生物計量及檢驗檢疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗室,浙江 杭州 310018)

沙門氏菌是一種常見的食源性致病菌,屬于革蘭氏陰性(Gram-negative)腸道桿菌.在大多數(shù)的沙門氏菌污染食品中毒事件中,腸炎沙門氏菌(Salmonellaenteritidis)引起的占大部分.沙門氏菌會造成人類的各種疾病如傷寒、腸胃炎、感染性腹瀉、發(fā)熱及嘔吐等.目前,對沙門氏菌的檢測主要是按照國標(biāo)規(guī)定進(jìn)行,其檢測程序復(fù)雜,檢測周期較長,且對于疑似致病菌的菌落的篩選也存在不確定性.因此,為了保障食品行業(yè)的健康發(fā)展,滿足食品安全檢測的快速準(zhǔn)確,亟需建立一種新的有效的快速檢測方法,來檢測和控制沙門氏菌的傳播,維護(hù)人民群眾的健康.

疊氮溴化丙錠(Propidium monoazide,PMA)是一種對核酸具有高度結(jié)合能力的光敏染料[1],它能夠與細(xì)胞壁或細(xì)胞膜不完整的死菌的DNA相結(jié)合,而不會與具有完整細(xì)胞壁或細(xì)胞膜的活菌細(xì)胞的DNA結(jié)合,從而可實(shí)現(xiàn)對食品中活菌的快速檢測[2-3].本文利用PMA的活細(xì)胞篩選功能,將PMA與熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)相結(jié)合,旨在建立能夠快速定量檢測沙門氏菌活菌的檢測方法,并避免檢測過程中的假陽性和假陰性的出現(xiàn).通過將PMA-qPCR應(yīng)用于畜禽肉類樣品的定量檢測,以獲得我國肉類食品中沙門氏菌污染程度的準(zhǔn)確定量監(jiān)測數(shù)據(jù),為開展食品安全風(fēng)險評估提供重要的科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

本文所用菌種為腸炎沙門菌(SalmonellaenteritidisCMCC 50335),PMA購于美國Biotium公司,二甲基亞砜、LB液體培養(yǎng)基和Taq酶購自Sangon Biotech公司,細(xì)菌DNA提取試劑盒購自Promega 公司,pMDTM18-T Vector Cloning Kit購自日本TaKaRa公司,熒光定量PCR儀購自BIO-RAD公司.

1.2 沙門氏菌活菌和死菌懸液的制備

取腸炎沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株CMCC 50335接種于LB培養(yǎng)液,37 ℃,120 r/min下振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期,取適量菌液進(jìn)行稀釋,通過營養(yǎng)瓊脂平皿培養(yǎng)計數(shù)得到含菌量為1.0×108CFU/mL的活菌懸液.將活菌懸液90 ℃水浴處理10 min滅活,冰上冷卻5 min,得到熱致死菌懸液.

1.3 PMA的配置

1.3.1 PMA儲存液及工作液配制

將PMA溶解于20%的二甲基亞砜中,配制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的PMA儲存液,-20 ℃避光保存.將上述配好的儲存液以二甲基亞砜稀釋10倍即為工作液.

1.3.2 最適PMA濃度的確定

取200 μL制備好的活菌懸液和死菌懸液加入一定量的PMA工作液,使PMA最終濃度分別為0、3、6、12、15、20和25 μg/mL,避光10 min后將樣品置于冰上,650 W鹵素?zé)粼诰鄻悠?0 cm處照射10 min后,按照最佳曝光時間進(jìn)行光反應(yīng),提取細(xì)菌DNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增和熒光定量PCR檢測[4].

1.3.3 混合菌液最適暗培育時間的確定

取100 μL活菌/死菌混合菌懸液加入一定量的PMA工作液,使PMA終濃度為12 μg/mL,分別避光孵育5、10、15、20、25 min后置于冰上,650 W鹵素?zé)粼诰鄻悠?0 cm處照射10 min,按照最佳曝光時間進(jìn)行光反應(yīng),提取菌液DNA做模板,進(jìn)行熒光定量PCR檢測.

1.3.4 最適PMA曝光時間的確定

取活菌懸液及死菌懸液200 μL各5份,加入適量PMA工作液,使PMA終濃度為12 μg/mL,充分混勻,避光孵育10 min,使PMA與樣品充分結(jié)合.然后置于冰上,650 W鹵素?zé)粝?0 cm處分別照射2、4、6、8和10 min.將未經(jīng)PMA處理的樣品設(shè)為陽性對照.提取經(jīng)PMA處理后的細(xì)菌DNA作為模板,進(jìn)行熒光定量PCR檢測,研究檢測PMA處理的最佳曝光時間.

1.3.5 活菌/熱致死菌混合菌懸液的PMA處理

分別按照活菌比例為0%、5%、10%、15%、30%、40%、60%、100%制備混合菌液,將未經(jīng)任何處理的活菌懸液作為對照.向各組細(xì)菌懸液中加入適量PMA工作液,使PMA終質(zhì)量濃度為12 μg/mL.用650 W的鹵素?zé)粼诰鄻悠?0 cm處避光照射10 min,按照最佳曝光時間進(jìn)行光反應(yīng),提取細(xì)菌DNA作模板,進(jìn)行熒光定量PCR檢測,觀察PMA對死菌的影響.

1.4 引物設(shè)計

以沙門氏菌invA基因(GenBank:M90846.1)為特異性基因設(shè)計引物和探針,引物序列見表1.

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.5 DNA提取

取0.6 mL菌液,用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取細(xì)菌DNA,將提取好的細(xì)菌DNA保存于-20 ℃?zhèn)溆?

1.6 PCR反應(yīng)體系

常規(guī)PCR:PCR Master mix 10 μL,上下游引物各0.5 μL,DNA模板2 μL,加水補(bǔ)足20 μL;熒光定量PCR: SYBR Green Realtime 13 μL,上游引物0.5 μL,下游引物0.5 μL,菌液DNA 5 μL,超純水6 μL.反應(yīng)程序:94 ℃ 1 min,94 ℃ 30 s,62 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,40個循環(huán),每個樣品重復(fù)3次,求出平均Ct值.

1.7 PMA-qPCR靈敏度分析

將含菌量為108CFU/mL的沙門氏菌活菌懸液依次進(jìn)行10倍稀釋,分別得到107至101CFU/mL 7個梯度的活菌懸液,利用上述獲得的最適PMA濃度、最適曝光時間及最適暗孵育時間處理樣品,然后將樣品進(jìn)行qPCR檢測,分析PMA-qPCR檢測方法的靈敏度.

1.8 市售畜禽樣品的人工污染

取10 g市售豬肉(腿肉,約克夏豬),用FDA推薦的傳統(tǒng)方法[9].證明不含沙門氏菌,研磨成無菌肉漿,分別加入上述含菌量為101～108CFU/mL的沙門氏菌活菌液.染菌樣品采用最適PMA處理條件處理后,按照說明書提取細(xì)菌DNA,以此為模板進(jìn)行熒光定量PCR檢測,利用標(biāo)準(zhǔn)曲線得到各組菌液的拷貝數(shù),將此拷貝數(shù)與傳統(tǒng)的計數(shù)法所得結(jié)果比較分析.

1.9 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示.運(yùn)用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析,各處理平均數(shù)之間用Duncan’s方法比較差異顯著性,顯著性水平設(shè)置為P<0.05.

2 結(jié)果與分析

2.1 最適PMA濃度的確定

利用不同濃度PMA處理熱致死菌懸液時,隨著PMA濃度的增加,PMA對熱致死菌懸液的擴(kuò)增抑制率逐漸增大(圖1),當(dāng)PMA濃度為12 μg/mL時,擴(kuò)增抑制率最大,達(dá)到97.5%;當(dāng)PMA濃度低于15 μg/mL時,PMA對活菌的檢出無影響,當(dāng)PMA濃度超過20 μg/mL時,活菌的檢出率明顯受到抑制(P<0.05),且隨著PMA濃度的升高,活菌抑制效果越明顯,提示利用濃度超過20 μg/mL的PMA處理菌液時,會出現(xiàn)假陰性.

圖1 最佳PMA濃度的選取Figure 1 Selection of the optimal concentration of PMA

2.2 最適培育時間及最適曝光時間的確定

利用12 μg/mL濃度PMA處理熱致死菌懸液,設(shè)置不同的暗孵育時間與曝光時間,提取細(xì)菌DNA作模板,優(yōu)化qPCR體系后進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增.從圖2—3可以看出,當(dāng)暗孵育時間為10 min時,PMA能與熱致死菌DNA完全交聯(lián),擴(kuò)增抑制率可達(dá)到98%(圖2)；PMA對熱致死菌懸液的抑制率隨著曝光時間的延長而上升,當(dāng)曝光時間大于6 min時,對熱致死菌懸液的抑制率可達(dá)到99%(圖3).結(jié)果提示,樣品加入PMA后,暗孵育10 min、曝光7 min為區(qū)分沙門氏菌活菌/死菌的最佳實(shí)驗條件.

圖2 不同暗孵育時間對PMA對菌懸液抑制率的影響Figure 2 Effect of dark incubation time on inhibition rate of PMA to bacterial suspension

圖3 不同曝光時間對PMA對菌懸液抑制率的影響Figure 3 Effect of exposure time on inhibition rate of PMA to bacterial suspension

2.3 PMA-qPCR方法的靈敏度檢測

10倍梯度稀釋沙門氏菌活菌懸液后,利用本文上述優(yōu)化的PMA處理條件處理活菌懸液,然后進(jìn)行熒光定量PCR檢測,獲得各個濃度菌液的Ct值,然后以Ct值為縱坐標(biāo),以各個菌液濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖4).結(jié)果顯示,菌液拷貝數(shù)與Ct值之間存在線性關(guān)系,回歸方程為y=-3.964 3x+39.857,相關(guān)系數(shù)(R2)為0.993 9.最低檢測限為10 CFU/mL.

圖4 PMA-qPCR靈敏度檢測Figure 4 Detection of the sensitivity of PMA-qPCR

2.4 活菌/熱致死菌細(xì)胞混合樣品的PMA處理效果

結(jié)果顯示(圖5),當(dāng)樣品中全部為死菌時,未經(jīng)PMA處理的樣品仍能測得Ct值,說明樣品中的死菌的擴(kuò)增未被抑制,仍然有擴(kuò)增信號;而經(jīng)PMA處理的樣品未測得Ct值,說明樣品中死菌DNA被PMA交聯(lián),PCR擴(kuò)增被抑制.Ct值隨著活菌含菌量的增加逐漸降低,也即菌液經(jīng)PMA處理后,用于擴(kuò)增的細(xì)菌DNA模板數(shù)量變少.當(dāng)樣品中全部為活菌時,未經(jīng)PMA處理的樣品的Ct值與PMA處理的樣品的Ct值比較,差異不顯著(P>0.05),這表明PMA能有效抑制死菌的擴(kuò)增而不影響活菌的檢出.

圖5 不同比例菌懸液的PMA-qPCR檢測結(jié)果Figure 5 Results of PMA-qPCR detection on the different proportion of live and dead bacteria

2.5 市售畜禽樣品中沙門氏菌的檢測

用不同含菌量的沙門氏菌液處理豬肉樣品進(jìn)行人工染菌,然后進(jìn)行PMA-qPCR檢測,利用所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣品的拷貝數(shù).結(jié)果顯示,當(dāng)菌液含菌量為101和102CFU/mL時均沒有擴(kuò)增信號出現(xiàn).當(dāng)菌液含菌量分別為103、104、105、106、107和108CFU/mL時可測得人工染菌樣品的拷貝數(shù).將PMA-qPCR結(jié)果與傳統(tǒng)的培養(yǎng)計數(shù)法結(jié)果進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),在103～108CFU/mL范圍內(nèi),沙門氏菌活菌的定量檢測結(jié)果與平皿計數(shù)法結(jié)果在統(tǒng)計學(xué)上無顯著性差異(P>0.05)(表2).

3 討論

如何有效的將樣品中的致病活菌檢測出來是當(dāng)前食品安全快速檢測工作中的關(guān)鍵.活細(xì)胞和死細(xì)胞以及細(xì)胞膜損傷細(xì)胞的區(qū)別在于:在擴(kuò)增的過程中,由于細(xì)胞壁的屏障作用,活細(xì)胞不會受到PMA的影響,在裂解過程中也不會與失活的PMA反應(yīng).通過這種方法,最終使死亡細(xì)胞中的DNA在核酸純化中被選擇性的剔除[8].隨著PMA染料在食品安全快速檢測領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛,許多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),PMA的作用效果受PMA的濃度、菌液含菌量、暗孵育與曝光時間及微生物致死方法的影響[5-6].活菌和死菌的最主要的區(qū)別在于細(xì)胞膜的完整性、通透性.死細(xì)胞和膜損傷細(xì)胞由于膜的完整性被破壞,PMA染料可以和其DNA結(jié)合,從而可以抑制這些細(xì)胞的檢出,活細(xì)胞具有完整的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),PMA不能與其DNA結(jié)合從而被擴(kuò)增.

表2 人工染菌豬肉樣品PMA-qPCR與平皿法計數(shù)檢測結(jié)果比較Table 2 Comparitive detection of artificially infected pork by using PMA-qPCR and plate counting methods

本文研究顯示,在最適PMA濃度和最適培育時間確定的條件下,曝光6 min,PMA就能夠充分的與細(xì)菌DNA分子發(fā)生共價交聯(lián),不參與交聯(lián)的PMA在光照下被鈍化消解.結(jié)果顯示,當(dāng)PMA濃度≥12 μg/mL時,PMA可有效地與死菌或細(xì)胞膜損傷細(xì)胞的DNA結(jié)合,從而導(dǎo)致死菌或細(xì)胞膜損傷細(xì)胞的擴(kuò)增被全面抑制.本研究進(jìn)一步研究了可有效抑制死菌DNA擴(kuò)增且對活菌DNA擴(kuò)增不產(chǎn)生影響的PMA濃度,結(jié)果顯示,當(dāng)PMA濃度逐漸增加到20 μg/mL時,活菌細(xì)胞膜或細(xì)胞壁受到損傷,從而造成活菌數(shù)量的減少,影響擴(kuò)增效果.因此,選取12 μg/mL的PMA濃度作為篩選活菌和死菌的最適濃度,可有效避免假陽性的干擾,同時也不影響活菌DNA的擴(kuò)增.祝儒剛[10]推薦的PMA檢測濃度為4 μg/mL,遠(yuǎn)低于本研究的12 μg/mL,但其需要的曝光時間為15 min,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于本研究曝光時間.本文研究結(jié)果也表明,曝光6 min后PMA可完全抑制樣品中死菌DNA的擴(kuò)增,同時也確保游離的PMA被全部鈍化.利用本研究優(yōu)化的條件,也即PMA濃度為12 μg/mL、光照6 min時,可有效排除檢測樣品中死菌或細(xì)胞膜損傷細(xì)胞DNA對擴(kuò)增的干擾,避免檢測過程中出現(xiàn)“假陽性”的情況,從而實(shí)現(xiàn)通過PMA-qPCR技術(shù)對沙門氏菌活菌的快速檢測.

4 結(jié)語

本研究所建立的PMA-qPCR方法既能有效地抑制死菌的擴(kuò)增,又不需要復(fù)雜的儀器即能完成反應(yīng),而且靈敏度較高,對沙門菌活菌的檢出限為10 CFU/mL.此方法可為食源性致病菌的檢測提供一種新思路.