杜福宏，宋良鵬，鄭徳偉

(日照市中醫(yī)醫(yī)院 神經(jīng)外科，山東 日照 276800)

腦卒中是嚴重危害人類健康和生命安全的常見難治性疾病，祖國醫(yī)學將其列為“風、癆、臌、膈”四大疑難病之首，具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率的特點[1]。其中，缺血性腦卒中約占卒中患者的75%左右，且易復發(fā)，給患者帶來嚴重的經(jīng)濟壓力和心理負擔。目前，缺血性腦損傷發(fā)病機制研究主要集中在谷氨酸神經(jīng)毒性、氧自由基損傷、炎性增加和神經(jīng)元凋亡等[2]，而其中谷氨酸神經(jīng)毒性和神經(jīng)元凋亡均與神經(jīng)元突觸可塑性障礙有關。研究表明，海馬內(nèi)谷氨酸含量增加能導致突觸后膜離子型谷氨酸受體NMDAR異常活化，使神經(jīng)元軸突、樹突復雜性下降而影響學習記憶功能[3]；神經(jīng)元數(shù)量的缺失則會使突觸傳導功能減弱，影響大腦功能，進而導致神經(jīng)精神疾病的發(fā)生[4]。補腎開竅祛痰方由《備急千金要方》中孔圣枕中丹加減而成，臨床研究證實能明顯改善腦卒中患者的運動能力及認知功能，具有良好的神經(jīng)功能保護作用[5]，但其能否通過調(diào)節(jié)神經(jīng)突觸可塑性而緩解神經(jīng)損傷尚未有實驗研究。因此，本實驗擬以缺血性腦損傷模型大鼠為研究對象，以海馬突觸可塑性為切入點，通過檢測突觸結構蛋白突觸素-1(Synapsin-1)、突觸后致密蛋白-95(PSD-95)和突觸功能蛋白鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ(CaMKII)、認知缺陷突觸相關蛋白(SynGap)的表達情況，探討補腎開竅祛痰方的神經(jīng)保護作用及作用機制，為缺血性腦卒中的中醫(yī)藥防治提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物 補腎開竅祛痰方由熟地黃、鹿角膠、紫河車、菟絲子、益智仁、石菖蒲、升麻、全蝎等藥物組成，原藥材購于河南省中醫(yī)院；依達拉奉注射液購自吉林博大制藥公司，規(guī)格10 mL/15 mg，批號80-140712。

1.2 實驗動物 SPF級健康雄性SD大鼠，50只，體質(zhì)量為180～220 g，由上海斯萊克動物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號為SCXK(滬)2017-0005。實驗期間大鼠均飼養(yǎng)在室溫(24±2)℃、相對濕度(50±5)%、光/暗周期12 h/12 h的屏障環(huán)境中，自由攝食飲水。

1.3 試劑與主要儀器 兔抗大鼠Synapsin-1、PSD-95、GAPDH單克隆抗體購自英國Abcam公司；兔抗鼠CaMKII、SynGap多克隆抗體購自美國CST公司；RIPA裂解液、BCA試劑盒購自美國Thermo公司；DAB試劑盒、蘇木素購自北京中杉金橋；山羊抗兔二抗購自武漢博士德公司；Axio Imager光學顯微鏡購自德國ZEISS；SpectraMax超微量核酸蛋白測定儀購自英國BioDrop；MK3酶標儀、RM2235手動輪轉(zhuǎn)式切片機購自美國Thermo；Gel Doc XR+凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國Bio-Rad。

1.4 動物分組、造模與給藥 50只SD大鼠適應性喂養(yǎng)3 d后，根據(jù)體質(zhì)量值隨機分為2部分，其中10只為假手術組，另外40只進行缺血性腦損傷模型制備。模型制備方法根據(jù)Longa線栓法[6]改進，大鼠麻醉后，固定四肢，酒精消毒頸部，行頸部正中切口，分離右側(cè)頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈，尼龍魚線結扎頸外動脈；在頸總動脈近分叉處插入備用魚線，用鑷子輕輕將栓線送至大腦中動脈起始處，平均進線(18.0±2.0)mm。假手術組只游離血管，不插入尼龍線。造模完成后，去除死亡大鼠，其余大鼠進行神經(jīng)功能缺損評分，根據(jù)評分情況將模型大鼠隨機分為4組，包括模型組、依達拉奉組、補腎開竅祛痰方低和高劑量組，每組10只。

分組完成后進行給藥，依達拉奉組給予腹腔注射陽性藥依達拉奉(3.2 mg/kg)，同時灌胃蒸餾水；補腎開竅祛痰方低、高劑量組分別灌胃給予該復方臨床等效1、2倍劑量(8.4、16.8 g/kg)，同時腹腔注射生理鹽水；假手術組與模型組灌胃蒸餾水，同時腹腔注射生理鹽水。各組大鼠灌胃體積為10 mL/kg，腹腔注射體積為4 mL/kg，連續(xù)給藥7 d。末次給藥完成后1 h，再次對所有大鼠進行神經(jīng)功能缺損評分，評分完成后麻醉大鼠，50%大鼠剝離海馬于液氮中保存，另外50%大鼠經(jīng)多聚甲醛灌注后取腦組織保存。

1.5 神經(jīng)功能缺損評分 參照Longa評分法對大鼠進行神經(jīng)功能缺損評分，評分越高，神經(jīng)損傷越嚴重。具體為0分：無明顯損傷，1分：腦缺血對側(cè)前肢伸展不完全，2分：行走過程中轉(zhuǎn)圈，3分：行走過程中傾倒，4分：不能自發(fā)行走，意識喪失。

1.6 免疫組化法檢測海馬CA1區(qū)突觸結構蛋白的表達 取固定于4%多聚甲醛溶液中的腦組織，石蠟包埋后切片，常規(guī)脫蠟，水化，滴加山羊血清封閉液，37 ℃孵育30 min，去除血清，加一抗(Synapsin-1，1∶100；PSD-95，1∶100)4℃孵育過夜；PBS洗3次，滴加HRP標記的山羊抗兔50 μL，37 ℃孵育30 min，PBS洗3次，DAB顯色，蘇木素復染，脫水，透明，樹膠封片，顯微鏡下觀察。選取3個不同的視野，借助Image Pro軟件分析積分光密度值(integral optical density,IOD)。

1.7 Western blot法檢測海馬突觸可塑性功能蛋白的表達 取冷凍保存的海馬組織，稱重，加入3倍體積的RIPA裂解液，冰上勻漿，在4 ℃、12 000 rpm條件下離心15 min，取上清液，BCA試劑盒法測定總蛋白含量。制備分離膠和濃縮膠，蛋白上樣，SDS-PAGE凝膠電泳至溴酚藍跑出分離膠后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，根據(jù)目的蛋白分子量裁剪條帶，分別加入稀釋后的一抗(CaMKII，1∶500；SynGap，1∶1 000；GAPDH，1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。次日用TBST液洗滌條帶4次，每次10 min，加入二抗室溫下孵育4 h，TBST液洗4次，每次10 min，之后進行ECL顯影。應用Image J軟件分析條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，根據(jù)目的蛋白和內(nèi)參蛋白對應灰度值的比值計算目的蛋白的相對表達水平。

2 結果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分 假手術組大鼠無神經(jīng)功能缺陷癥狀，模型組大鼠行走時會表現(xiàn)出轉(zhuǎn)圈或向一側(cè)傾倒的現(xiàn)象，神經(jīng)功能缺損明顯，評分最高；與模型組比較，依達拉奉組和補腎開竅祛痰方高劑量組大鼠神經(jīng)功能缺損評分顯著下降(P<0.01)，同時補腎開竅祛痰方低劑量組也有較明顯的改善作用(P<0.05，見表1)。

組別神經(jīng)功能缺損評分給藥前給藥7 d后假手術0 0模型 3.05±0.543.15±0.67依達拉奉 3.08±0.511.54±0.37??##補腎開竅祛痰方低劑量 3.06±0.482.21±0.40?#補腎開竅祛痰方高劑量 3.06±0.521.92±0.34??##

與模型組比較，*：P<0.05，**：P<0.01；與給藥前比較，#：P<0.05，##：P<0.01。

2.2 各組大鼠海馬CA1區(qū)突觸結構蛋白Synapsin-1、PSD-95表達 與假手術組比較，模型組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元缺失明顯，細胞排列散亂，突觸前膜標記蛋白Synapsin-1和突觸后膜標記蛋白PSD-95陽性細胞數(shù)明顯變少，積分光密度值顯著減弱(P<0.01)；高劑量補腎開竅祛痰方干預后，大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量增加、排列趨于整齊，Synapsin-1、PSD-95積分光密度值顯著增強(P<0.01，見圖1～2、表2)。

A：假手術組；B：模型組；C：依達拉奉組；D：補腎開竅祛痰方低劑量組；E：補腎開竅祛痰方高劑量組。圖1 各組大鼠海馬CA1區(qū)Synapsin-1免疫組化染色結果(×400)

A：假手術組；B：模型組；C：依達拉奉組；D：補腎開竅祛痰方低劑量組；E：補腎開竅祛痰方高劑量組。圖2 各組大鼠海馬CA1區(qū)PSD-95免疫組化染色結果(×400)

組別Synapsin-1PSD-95假手術0.78± 0.110.81± 0.10模型0.43±0.06?? 0.41±0.07??依達拉奉0.71±0.09##0.68±0.08##補腎開竅祛痰方低劑量 0.59±0.07# 0.57±0.08補腎開竅祛痰方高劑量 0.68±0.10## 0.67±0.07##

與假手術組比較，**：P<0.01；與模型組比較，#：P<0.05，##：P<0.01。

2.3 各組大鼠海馬突觸可塑性功能蛋白CaMKII、SynGap表達 與假手術組比較，模型組大鼠海馬突觸可塑性功能蛋白CaMKII、SynGap表達顯著下調(diào)(P<0.01)；與模型組比較，依達拉奉組和補腎開竅祛痰方高劑量組大鼠海馬CaMKII、SynGap表達顯著上調(diào)(P<0.01)，此外，低劑量的補腎開竅祛痰方能上調(diào)大鼠海馬CaMKII蛋白的表達(P<0.05，見圖3、表3)。

A：假手術組；B：模型組；C：依達拉奉組；D：補腎開竅祛痰方低劑量組；E：補腎開竅祛痰方高劑量組。圖3 各組大鼠海馬CaMKII、SynGap蛋白表達

組別CaMKIISynGap假手術0.51± 0.070.47± 0.07模型0.24±0.03?? 0.23±0.04??依達拉奉0.48±0.06##0.39±0.06##補腎開竅祛痰方低劑量 0.35±0.05#0.31±0.05補腎開竅祛痰方高劑量 0.41±0.06## 0.40±0.06##

與假手術組比較，**：P<0.01；與模型組比較，#：P<0.05，##：P<0.01。

3 討論

缺血性腦卒中屬中醫(yī)“中風”、“卒中”范疇，其病機為因虛致瘀，瘀阻腦絡，與腎、心、腦有關，中醫(yī)防治當以益氣化瘀、活血開竅為法則[7]。補腎開竅祛痰方是以《備急千金要方》中孔圣枕中丹為基礎方，經(jīng)化栽而得的臨床經(jīng)驗方，全方共奏填精補髓、開竅祛痰、健腦益智之功效，在治療腦卒中、腦癱及其并發(fā)癥等疾病上療效顯著。本研究通過探明補腎開竅祛痰方對缺血性腦損傷大鼠海馬突觸可塑性的影響，闡述其減緩神經(jīng)損傷、保護腦組織的機制，對于該復方的進一步開發(fā)具有重要意義。

突觸可塑性是指在外環(huán)境作用下，神經(jīng)元形態(tài)和功能發(fā)生較為持久的適應性變化來維持神經(jīng)系統(tǒng)的相對穩(wěn)定，可分為結構可塑性和功能可塑性。生理狀態(tài)下，神經(jīng)信號的傳遞依賴突觸前神經(jīng)元釋放的神經(jīng)遞質(zhì)與突觸后對應受體結合，將信號逐一傳遞，發(fā)揮生理功能；而在病理狀態(tài)下，突觸可塑性障礙是導致認知功能改變及多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生的重要原因[8]。Synapsin-1和PSD-95分別是突觸前、后膜的標記蛋白，Synapsin-1是一種突觸素，其表達水平?jīng)Q定了突觸的數(shù)量和密度；PSD-95是突觸后致密區(qū)核心構架蛋白之一，能影響突觸連接的形成，反映突觸結構的活性[9]。CaMKII是一種廣泛分布于海馬組織的多功能絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，被稱為記憶功能分子，主要表達于突觸后致密部位，具有Ca2+依賴性的自動磷酸化特性[10]。SynGap是一種位于突觸的Ras GTP酶激活蛋白(Ras Gap)，在突觸興奮狀態(tài)下高表達，是CaMKII的主要催化底物[11]。CaMKII是Ca/CaM通路的下游信號分子，也是長時程增強(LTP)產(chǎn)生的關鍵信號，研究表明，神經(jīng)興奮傳遞至突觸后膜，Ca2+通道開放，Ca2+大量內(nèi)流并進一步激活CaM進而引發(fā)CaMKII蛋白Thr286位點磷酸化，CaMKII活化后，催化SynGap，使其Ras GTP酶活性受到抑制，從而誘導LTP的發(fā)生，最終參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元突觸可塑性及機體學習記憶過程[12-13]。

本研究采用免疫組化法檢測海馬關鍵區(qū)域CA1區(qū)突觸結構蛋白Synapsin-1和PSD-95的表達發(fā)現(xiàn)，補腎開竅祛痰方能逆轉(zhuǎn)缺血性腦損傷模型大鼠突觸結構蛋白的低表達水平，增強其免疫陽性；同時，檢測海馬組織突觸功能蛋白CaMKII和SynGap表達發(fā)現(xiàn)，補腎開竅祛痰方能顯著上調(diào)模型大鼠突觸功能蛋白的表達。上述結果說明，補腎開竅祛痰方能通過調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元突觸結構和功能蛋白的表達發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，補腎開竅祛痰方能顯著改善缺血性腦損傷大鼠的神經(jīng)損傷情況，其作用機制可能與調(diào)節(jié)海馬突觸可塑性有關。本研究結果對于進一步闡明缺血性腦卒中的發(fā)病機制以及篩選治療該疾病的復方中藥提供了理論依據(jù)，下一步擬進行更深入的機制研究。