季文平 陳夕軍* 何 超 賀 振 魏利輝 劉郵洲 張 青 黃奔立*

（1揚州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，江蘇揚州 225009；2江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，江蘇南京210014；3蘇州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江蘇蘇州 215155）

辣椒是人們?nèi)粘Ｉ钪械闹匾卟酥?，在世界各地廣泛栽培。我國是辣椒主要種植國，鮮辣椒和干辣椒均是我國外貿(mào)出口的重要產(chǎn)品，產(chǎn)品遠(yuǎn)銷新加坡、菲律賓、韓國和日本等國。近年來，我國辣椒種植面積不斷擴大，已達(dá)150萬hm2左右，且有進(jìn)一步擴展的趨勢（鄭井元 等，2018）。但由辣椒疫霉（Phytophthora capsiciLeonian）引起的疫病降低了辣椒的產(chǎn)量和品質(zhì)，制約了辣椒產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展（Wang et al.，2016）。

辣椒疫病是一種土傳病害，主要以卵孢子在土壤病殘體中越冬，當(dāng)土溫高于18 ℃，氣溫在24～29 ℃且空氣濕度較大時，該病擴展迅速，病菌孢子囊和游動孢子可通過氣流和雨水快速傳播（Jiang et al.，2006；Babadoost et al.，2016；Koc et al.，2017）。因該病在田間暴發(fā)性強，化學(xué)防治便以其方便、快捷、高效而成為防治措施中的首選。近幾十年來，已有多種新型殺菌劑在生產(chǎn)上加以應(yīng)用，但隨著用藥時間的延長和用藥頻率的增加，辣椒疫病菌已對這些藥劑產(chǎn)生了抗藥性，且化學(xué)藥劑易造成食品與環(huán)境污染，也不符合人們對于安全、優(yōu)質(zhì)農(nóng)產(chǎn)品與生態(tài)環(huán)境的需求。因此，尋找可有效控制辣椒疫病的生物源物質(zhì)顯得尤為迫切。

生物源物質(zhì)指來源于動物、植物和微生物及其次生代謝物，或經(jīng)過改造仿生合成的高活性、強特異性物質(zhì)。因其來源于自然界，對環(huán)境相對友好，從而被開發(fā)成農(nóng)藥、肥料、生長調(diào)節(jié)劑和生物誘抗劑等（湯日圣 等，2006；Hubert et al.，2008；郭默然，2014；Singh & Strong，2015）。大蒜作為一種中藥與調(diào)味料，其粗提物甚至某些化學(xué)組分已被證明有藥用與殺菌的功能，如大蒜素和阿霍烯等（Singh &Chauhan，1992；Bagul et al.，2015；Edward et al.，2017）。這些物質(zhì)在高濃度時可抑制真菌菌絲生長、孢子囊形成與孢子萌發(fā)，并與病菌細(xì)胞內(nèi)帶有巰基的化學(xué)物質(zhì)結(jié)合，從而降低病菌體內(nèi)氨基酸的攝入量、氧氣的消耗量及酸性和堿性磷酸酯酶的活性（Miron et al.，2000）。但大蒜粗提物成分復(fù)雜，究竟哪些物質(zhì)在其中起主要作用，還并不十分清楚。本試驗擬通過對大蒜粗提物抗菌成分進(jìn)行分析，找到適用于辣椒疫病防控的大蒜次生代謝物質(zhì)，從而為新型農(nóng)藥的研制與辣椒疫病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

辣椒品種為茄門甜椒（購于揚州市蔬菜種子有限公司），易感辣椒疫病。用55 ℃溫水浸泡辣椒種子3～4 h，清水淋洗后將種子放入墊有潮濕紗布的培養(yǎng)皿中，26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中催芽。待種子露白后穴播于裝有伯爵泥炭BM-2育苗基質(zhì)的塑料穴盤中，每穴3～4粒種子，22～24 ℃溫室中培養(yǎng)至6片真葉，備用。

大蒜品種為白皮蒜，購自揚州市區(qū)農(nóng)貿(mào)市場。將蒜種點播于裝有營養(yǎng)土的塑料花盆中（盆口直徑14 cm，高10 cm），每盆4瓣，22～24 ℃溫室中培養(yǎng)至5片葉，備用。

辣椒疫病菌YM-103，分離自江蘇辣椒疫病病株，經(jīng)形態(tài)與分子生物學(xué)鑒定，并通過柯赫氏法則驗證。

1.2 大蒜粗提物的制備

大蒜植株拔起、洗凈后晾干，將植株分成根、莖葉和鱗莖3部分，取根、莖葉和鱗莖各30 g，剪碎后分別加入少量石英砂研磨。經(jīng)減壓抽濾后，用無菌水將濾液定容至20 mL，配制成1 500 mg·mL-1母液，經(jīng)細(xì)菌濾器過濾后備用。

1.3 大蒜粗提物對辣椒疫病菌生長的抑制作用測定

在90 mL馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基中加入大蒜粗提物母液，配制成含粗提物濃度為37.5、75.0、150.0 mg·mL-1的培養(yǎng)基，制成平板。用打孔器從活化的辣椒疫病菌菌落邊緣取直徑5 mm的菌絲塊，置于含大蒜粗提物的平板中央，28℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，2 d后開始測量直徑，每隔24 h測量1次，共測量4次，計算抑菌率。每處理4次重復(fù)，以清水作對照。

1.4 大蒜粗提物對辣椒疫病的防效測定

1.4.1 辣椒疫病菌孢子懸浮液的制備 參照Chen等（2011）的方法制備辣椒疫病菌孢子懸浮液：將辣椒疫病菌活化后接種于胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基，25℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)4 d，再置于光照培養(yǎng)箱中同溫度培養(yǎng)2 d。向培養(yǎng)皿中加入10 mL無菌水，放置于室溫下10 min，4 ℃下10 min，室溫下20 min，即有大量游動孢子釋放。將孢子洗下，經(jīng)兩層紗布過濾后加無菌水稀釋，配制成含孢子1×106個·mL-1的孢子懸浮液用于接種。

1.4.2 大蒜粗提物的防效測定 將長勢一致的6葉期辣椒苗移栽至裝有滅菌土的塑料盆中，7 d后接種辣椒疫病菌，每株澆灌孢子懸浮液10 mL。1 h后，分別將配制好的大蒜根、莖葉和鱗莖粗提物37.5、75.0、150.0 mg·mL-1倒入辣椒苗近基部土壤中，每盆15 mL，每處理10盆，3次重復(fù)，以倒入清水作對照。保濕24 h，7 d后調(diào)查發(fā)病情況，計算病情指數(shù)與防治效果。辣椒疫病嚴(yán)重度分級標(biāo)準(zhǔn)（Chen et al.，2011）：0級，無病癥；1級，幼苗根部輕微變黑，葉片不萎蔫或可恢復(fù)性萎蔫；2級，幼苗根莖部變黑達(dá)1～2 cm，葉片不可恢復(fù)性萎蔫，下部葉片偶有脫落；3級，幼苗根莖部變黑超過2 cm，葉片明顯萎蔫或落葉明顯；4級，幼苗根部變黑縊縮，除生長點外全部落葉或植株萎蔫；5級，整株枯死。

1.5 大蒜粗提物中揮發(fā)性物質(zhì)的成分測定

稱取大蒜根、莖葉、鱗莖各20 g，分別加入200 mL去離子水于組織粉碎機中粉碎，將粉碎的樣品倒入250 mL錐形瓶中，加入轉(zhuǎn)子，用封口膜密封，放在40 ℃恒溫磁力攪拌器上快速攪拌。將固相微萃取裝置（美國Supelco公司）的萃取頭（PDMS，100 μm）針頭插入封口膜，并小心將萃取頭推出，同時用鐵架臺固定固相微萃取手柄。自萃取頭推出后開始計時，對揮發(fā)物提取2 h。在萃取頭捕集樣品前，先將其在氣相色譜進(jìn)樣口內(nèi)（250℃）熱解吸20 min，以保證萃取頭中無雜質(zhì)和其他污染物。

氣相色譜檢測條件：毛細(xì)管柱為美國惠普公司HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm），GC進(jìn)樣口溫度為280 ℃，爐溫程序升溫至50 ℃并保持3 min，然后以8 ℃·min-1的速度升溫至300 ℃，保持3 min；EI離子源，離子源溫度280 ℃，載氣為氦氣（流速1 mL·min-1），電子轟擊能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍50～550 amu，不分流。

對大蒜粗提物總離子流圖中的峰面各進(jìn)行歸一化法測量，明確各組分的百分含量，各組分圖譜在NIST譜庫中自動檢索后選用高相關(guān)結(jié)果。

1.6 外源添加的硫醚類有機硫化物對辣椒疫病菌生長的抑制作用測定

分別配制含10、20、50、100 mg·L-1的甲基丙基二硫醚、二烯丙基硫醚、二烯丙基二硫醚和二烯丙基三硫醚的含藥培養(yǎng)基，制成平板。在剛剛活化好的辣椒疫病菌菌落邊緣取5 mm菌絲塊接種至平板中央，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，4 d后測量菌落直徑，以空白培養(yǎng)基作對照，按1.3的方法計算抑菌率。每處理4次重復(fù)。

1.7 與大蒜輪作對辣椒疫病的控制效果測定

2010～2016 年在揚州大學(xué)農(nóng)場蔬菜田進(jìn)行輪作試驗，3月上旬移栽茄門甜椒，辣椒苗移栽后15 d用含孢子1×106個·mL-1的孢子懸浮液灌根接種，保持田間濕度，待田間植株普遍發(fā)病后（病株率＞80%）進(jìn)入正常管理，作為病田土備用。同年9月中旬，在清除田間病殘體后，分別種植大蒜和茄門甜椒。次年3月上旬，分別取大蒜田和茄門甜椒田表層土（＜20 cm）裝盆（盆口直徑14 cm，高10 cm，裝土1 000 g）備用。將長勢一致的茄門甜椒苗（6葉期）移至裝有病土的盆中，每盆1株，每種病土栽種10盆，3次重復(fù)。保濕24 h，7 d后調(diào)查發(fā)病情況，計算病情指數(shù)與防治效果。

1.8 與大蒜混栽對辣椒疫病的控制效果測定

將辣椒疫病病莖剪成0.5 cm小段，每盆加入10 g與滅菌土混勻，模擬田間病殘體，將長勢一致的大蒜（5葉期）與茄門甜椒（6葉期）混栽于盆中，兩植株相距5 cm，以單獨移栽甜椒苗為對照。每處理10盆，3次重復(fù)，保濕24 h，25 ℃溫室中培養(yǎng)30 d后調(diào)查發(fā)病情況，計算病情指數(shù)與防治效果。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)的方差分析與多重比較均使用DPS V6.55軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 大蒜粗提物對辣椒疫病菌生長的抑制作用

由表1可知，不同濃度的大蒜根、莖葉和鱗莖粗提物對辣椒疫病菌均有很好的抑制作用，且濃度越高，抑制作用越強。3種粗提物中，以大蒜鱗莖粗提物抑制作用最強，濃度為150.0 mg·mL-1時，菌絲不再生長。除了150.0 mg·mL-1的鱗莖粗提物在培養(yǎng)5 d后對辣椒疫病菌的抑制率仍為100.00%外，莖葉、根粗提物以及鱗莖低濃度粗提物均隨時間推移對病菌的抑制率有所下降。這一結(jié)果表明，大蒜粗提物中的抑菌物質(zhì)可能是一些揮發(fā)性物質(zhì)，隨著時間的推移因物質(zhì)揮發(fā)而抑制作用下降。

表1 不同濃度大蒜根、莖葉和鱗莖粗提物對辣椒疫病菌生長的抑制作用

2.2 大蒜粗提物對辣椒疫病的防治效果

大蒜不同部位粗提物對辣椒疫病均有一定防治效果，且濃度越高，防治效果越好。在所有粗提物中，以150.0 mg·mL-1鱗莖粗提物的防效最高，達(dá)59.38%；莖葉粗提物濃度為37.5 mg·mL-1時，防效僅為19.17%；相同濃度大蒜不同部位粗提物，均以鱗莖粗提物對辣椒疫病的防治效果最好，與其他部位粗提物防效差異顯著（圖1）。

圖1 大蒜不同部位粗提物對辣椒疫病的防治效果

2.3 大蒜粗提物主要化學(xué)成分分析

圖2 大蒜根、莖葉和鱗莖粗提物揮發(fā)性成分總離子流圖

對大蒜根、莖葉和鱗莖粗提物揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行GC-MS分析，得到各粗提物總離子流圖（圖2）。 結(jié)果表明，大蒜根、莖葉和鱗莖粗提物中揮發(fā)性物質(zhì)均以硫化物為主，分別占總揮發(fā)性物質(zhì)的92.14%、90.65%和92.85%，但其組成成分和含量有明顯差別。根粗提物中揮發(fā)性物質(zhì)有20種，主要成分為二烯丙基二硫醚（46.73%）、二烯丙基硫醚（15.73%）、2，4-二甲基噻吩（8.51%）、草胺酰肼（7.25%）、1，2-二硫環(huán)戊烷（7.21%）和三硫代碳酸亞乙烯酯（5.93%）；莖葉粗提物中揮發(fā)性物質(zhì)有19種，主要成分為二烯丙基二硫醚（45.15%）、二烯丙基硫醚（19.03%）、草胺酰肼（8.83%）、三硫代碳酸亞乙烯酯（6.55%）；鱗莖粗提物中揮發(fā)性物質(zhì)有23種，主要成分為二烯丙基二硫醚（51.86%）、二烯丙基硫醚（15.59%）、2，4-二甲基噻吩（12.09%）和三硫代碳酸亞乙烯酯（5.99%）（圖2、表2）。由表2可知，大蒜根、莖葉和鱗莖粗提物中的硫化物以一硫化物和二硫化物為主，一硫化物以二烯丙基硫醚為主，二硫化物以二烯丙基二硫醚為主，而在大蒜根、莖葉粗提物中均大量存在的草胺酰肼在鱗莖粗提物中并不存在，在大蒜根、鱗莖中均大量存在（10%左右）的2，4-二甲基噻吩在莖葉中的含量只是根、鱗莖的1/5左右。

表2 大蒜根、莖葉和鱗莖中揮發(fā)性物質(zhì)成分及相對含量

2.4 外源添加幾種硫醚類有機硫化物對辣椒疫病菌生長的影響

向培養(yǎng)基中加入甲基丙基二硫醚、二烯丙基硫醚、二烯丙基二硫醚和二烯丙基三硫醚后，辣椒疫病菌的生長均受到明顯的抑制，且濃度越高抑制作用越明顯。在低濃度情況下，幾種有機硫化物對辣椒疫病菌生長的抑制作用差異并不明顯，但二烯丙基三硫醚在100 mg·L-1濃度下對辣椒疫病菌的抑制作用要明顯高于其他幾種硫化物，達(dá)60.55%（圖3）。這一結(jié)果表明，在大蒜粗提物對辣椒疫病菌生長的抑制過程中，多種有機硫化物參與了作用，且與其他硫醚類有機硫化物相比，二烯丙基三硫醚具有更強的抑菌作用。

2.5 大蒜與辣椒輪作或混栽對辣椒疫病的控制效果

將大蒜與辣椒輪作或混栽對辣椒疫病有很好的控制效果（表3），防效分別達(dá)59.81%和62.09%，說明采用與大蒜輪作或混栽的方式是田間防控辣椒疫病的一種有效手段。

圖3 不同硫醚類有機硫化物純品對辣椒疫病菌生長的影響

表3 大蒜與辣椒輪作或混栽對辣椒疫病的控制效果

3 結(jié)論與討論

大蒜既是人們喜歡的食品，也是一種廣泛用于治療各種疾病的藥用植物，甚至對人的學(xué)習(xí)能力與記憶力均有促進(jìn)作用（Roychoudhury et al.，1993；張庭廷 等，2007；Mukherjee & Banerjee，2013；Bagul et al.，2015）。對大蒜中活性成分的研究始于1844年，德國化學(xué)家Theoder Wertheim利用水蒸氣蒸餾大蒜得到了一些揮發(fā)性物質(zhì)，并確定其為烯丙基硫化物。后來國內(nèi)外學(xué)者分別采用水蒸氣蒸餾法（或同時蒸餾法）、有機溶劑浸出法、超臨界二氧化碳萃取法等從大蒜中提取到不同的風(fēng)味物質(zhì)，如小分子硫醚化合物、蒜氨酸、二烯丙基硫代亞磺酸酯（大蒜素）、二烯丙基二硫化物、二烯丙基三硫化物和二烯丙基四硫化物等（Amagase et al.，2001）。但不同提取方法所得各物質(zhì)含量并不相同。乙醇提取法所獲得的大蒜提取物主要成分為3-乙烯基〔4H〕-1，2-二噻烯和2-乙烯基〔4H〕-1，2-二噻烯，約占提取物總量的55.80%，二烯丙基二硫化物僅占4.58%，二烯丙基三硫化物為1.46%；而同時蒸餾法所得提取物則以二烯丙基二硫化物含量最高，占28.28%，3-乙烯基〔4H〕-1，2-二噻烯和2-乙烯基〔4H〕-1，2-二噻烯的含量只占0.44%和1.04%（韓月峰，2007）。不同提取方法所得產(chǎn)物及其含量差異較大可能是由于蒸餾法操作溫度高、操作時間長，從而使得許多化學(xué)成分分解；而有機溶劑浸出法則因為溶劑的極性，使得提取并不完全。本試驗對大蒜組織進(jìn)行破碎后直接連接至固相微萃取裝置，并連接氣相色譜儀測定其揮發(fā)物，時間短、成分沒有散失，應(yīng)能更準(zhǔn)確檢測大蒜粗提物中揮發(fā)物的種類及各物質(zhì)含量。

作為醫(yī)藥，大蒜廣泛應(yīng)用于保護(hù)動物心臟免受阿霉素誘導(dǎo)的中毒，通過影響肝臟相關(guān)生物轉(zhuǎn)化酶和抗氧化劑活性來改變癌癥的進(jìn)程，亦或用來緩解因化學(xué)農(nóng)藥導(dǎo)致的生殖毒性等（Arivazhagan et al.，2000；Alkreathy et al.，2010；Assayed et al.，2010）。近年來，大蒜提取物也被逐步應(yīng)用于植物病害的防治。生物測定表明，大蒜提取物對許多植物病原菌，如土壤桿菌、歐文氏菌、假單胞菌、黃單胞菌、鏈格孢菌、灰葡萄孢菌、灰梨孢菌、青霉菌、霜霉菌和疫霉菌均有抑制作用（Curtis et al.，2004；Daniel et al.，2015）。 大 蒜鱗莖提取物對辣椒疫病菌的抑制作用主要表現(xiàn)在抑制菌絲生長和孢子萌發(fā)，并對其菌絲有破壞作用，造成菌絲腫大、原生質(zhì)凝集和菌絲體滲透率增高等（Su & Cheng，2008）。施用于田間，大蒜提取物對辣椒疫病、番茄灰霉病、番茄葉霉病、西瓜枯萎病等均有很好的控制效果，特別是對辣椒疫病，無論是抗性品種還是感病品種，大蒜粗提物對其預(yù)防與治療效果均達(dá)80%以上，150.0 mg·mL-1處理濃度下，對抗病品種辣椒疫病的預(yù)防效果甚至達(dá)到100%（Curtis et al.，2004；程智慧 等，2008；Su & Cheng，2008；尉婷婷 等，2010；Wei et al.，2012；Daniel et al.，2015）。但所有這些研究均是以粗提物或混合物為對象，有關(guān)大蒜提取物中到底是哪一種物質(zhì)或哪幾種物質(zhì)在混合起作用，且其不同部位提取物是否不同并沒有詳細(xì)報道。本試驗通過氣相色譜明確了大蒜根、莖葉和鱗莖中揮發(fā)性物質(zhì)的種類和各物質(zhì)含量并不相同，但均以硫醚化合物為主，占60%以上。且這些硫化物對辣椒疫病菌的生長均具有很好的抑制作用。將大蒜與辣椒輪作或混栽，這些硫化物可很好地控制辣椒疫病的發(fā)生，防效可達(dá)60%左右。這些結(jié)果說明大蒜揮發(fā)性物質(zhì)在辣椒疫病的綠色防控上有很好的應(yīng)用前景。