黃修梅 李 明* 戎素萍 胡 云 楊 進 張艷彥

（1內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學職業(yè)技術(shù)學院，內(nèi)蒙古包頭 014019；2烏蘭察布市種子管理站，內(nèi)蒙古烏蘭察布011800）

內(nèi)蒙古是我國馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)之一，規(guī)?；图s化生產(chǎn)給企業(yè)和種植戶帶來經(jīng)濟效益的同時，也使土壤中微生物多樣性減少，土傳病害嚴重，馬鈴薯產(chǎn)量與質(zhì)量下降，危害馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。內(nèi)蒙古也是我國玉米的主產(chǎn)區(qū)，每年產(chǎn)生大量的玉米秸稈，利用玉米秸稈制備生物炭在土壤改良和促進作物生長等方面的應(yīng)用價值已被很多研究證實（王欣 等，2015）。生物炭自身富含有機碳和一定量的礦物質(zhì)養(yǎng)分，具有微孔結(jié)構(gòu)和官能團以及較大的比表面積（夏亞真 等，2018），可改善土壤理化性質(zhì)和生物學特性，提升土壤肥力，增加土壤營養(yǎng)元素，改善離子交換量，為有益微生物提供良好的生態(tài)環(huán)境，使作物產(chǎn)量得到提高（李明 等，2016）。土壤微生物群落在土壤生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著極其復雜的作用，也是影響土壤健康的一個重要因素（van Zwieten et al.，2010）。真菌是土壤微生物的主要組成部分，可以有效降解土壤中復雜組分和凋落物（邢來君和李明春，2001）、驅(qū)動養(yǎng)分循環(huán)（盛玉鈺 等，2018）、促進作物生長（李發(fā)虎 等，2017）。因此了解生物炭如何影響土壤微生物生長和作物產(chǎn)量對于確保土壤質(zhì)量、維持土壤子系統(tǒng)的完整性至關(guān)重要。本文采用高通量測序技術(shù)，研究玉米秸稈生物炭改良土壤對馬鈴薯根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)和產(chǎn)量的影響，以期為生物炭在土壤改良和馬鈴薯優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為內(nèi)蒙古馬鈴薯主栽品種克新1號原原種。供試生物炭購自遼寧金和福農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司。當年產(chǎn)的玉米秸稈在半封閉低溫炭化爐內(nèi)400℃缺氧條件下燃燒8 h，主要性質(zhì)為：C、N、H質(zhì)量分數(shù)分別為47.17%、0.71%、3.83%，碳氮比為67.03，pH值為9.04，有機質(zhì)、速效磷、堿解氮和速效鉀含量分別為925.74、394.18、159.15、783.98 mg·kg-1。

1.2 試驗設(shè)計

試驗于 2016～2017年在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學科技園區(qū)進行。采用田間試驗法，共設(shè)4個處理：T1為對照（CK），不添加生物炭；T2、T3和T4分別為播種前在土壤表層0～30 cm 處均勻添加10、20、40 t·hm-2生物炭。4月25日播種馬鈴薯，行距70 cm，株距33 cm，小區(qū)面積16 m2，隨機區(qū)組排列，3次重復，田間管理同常規(guī)大田管理。

1.3 指標測定

在馬鈴薯收獲時（9月5日），去除表面土壤，用抖落法分別取各處理的9株樣地根際0～20 cm處土壤均勻混合，測定真菌物種群落。同時，測定馬鈴薯單株產(chǎn)量、單株結(jié)薯數(shù)、商品薯率。真菌菌群測定采用ITS（internal transcribed spacer）高通量測序平臺，遵循Illumina測序儀文庫構(gòu)建方法，以ITS2為目標區(qū)域進行引物設(shè)計，50 ng的DNA模板、25 μL PCR體系，Phusion酶擴增25～35個循環(huán)，一輪PCR擴增反應(yīng)后，在正反向引物兩端分別加上不同Barcode以區(qū)分不同的樣本，擴增后的PCR產(chǎn)物使用Beads純化，用AxyPrepTM Mag PCR Normalizer試劑盒做歸一化處理，將構(gòu)建好的文庫上樣cBots或簇生成系統(tǒng)，用于簇生成及MiSeq測序。對于MiSeq測序的雙端數(shù)據(jù)首先根據(jù)Barcode信息進行樣品區(qū)分，然后根據(jù)Overlap關(guān)系進行Merge拼接成Tag，接著進行數(shù)據(jù)過濾、Q20和Q30質(zhì)控分析，對最終Clean數(shù)據(jù)進行OTU（operational taxonomy unit）聚類分析和物種分類學分析。

商品薯率測定：按大小分級，75 g以上為商品薯，商品薯率即商品薯所占的質(zhì)量百分比。于9月5日實收測單株產(chǎn)量，統(tǒng)計單株結(jié)薯數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS 19.0軟件進行分析。采用11.3版本的RDP（Ribosomal Database Project）數(shù)據(jù)庫進行真菌物種分類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物炭對馬鈴薯根際土壤真菌群落多樣性的影響

對4個處理土壤進行測序共獲得原始序列108 729條，篩選后獲得優(yōu)質(zhì)序列108 517條。其中T1～T4處理高質(zhì)量序列分別為11 056、10 396、49 236、37 829條。OTU即可操作分類單元，為用于物種分類及物種相對豐度分析的基本單元。如圖1所示，隨著測序量的不斷增大，各樣品OTUs數(shù)目的增加趨于平緩，達到飽和，說明測序數(shù)據(jù)量合理，能夠真實地反映土壤樣本的真菌群落。

圖1 不同處理土壤真菌的稀釋曲線

Chao1指數(shù)常用來估計物種總數(shù)，其數(shù)值越大，表示物種種類越多。Shannon指數(shù)，也稱香濃指數(shù)，不只關(guān)心物種豐富度，同時關(guān)心物種的均勻度。Simpson指數(shù)用于分析微生物群落的優(yōu)勢度，其數(shù)值越大，說明微生物的優(yōu)勢越明顯。對真菌群落多樣性的非參數(shù)估計表明（表1），添加生物炭各處理的Chao1指數(shù)明顯低于對照（T1），表明添加生物炭處理后土壤真菌群落物種總數(shù)明顯下降，其中T3處理最低，比對照降低41.1%。添加生物炭處理的Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)均低于對照，表明添加生物炭后，土壤真菌的豐富度或均勻度明顯下降。

表1 生物炭處理對根際土壤真菌多樣性指數(shù)的影響

圖2為反映各處理土壤真菌物種進化關(guān)系的系統(tǒng)發(fā)育進化樹，通過顏色梯度及相似程度來反映生物炭處理在各分類水平上真菌群落組成的相似性、多樣性及豐富度。進化樹環(huán)形部分文字為分類等級，由內(nèi)到外等級由低到高，節(jié)點大小表示豐度高低，綠色覆蓋區(qū)域表示低豐度，紅色覆蓋區(qū)域表示高豐度。從圖2可知，與對照（T1）相比，各生物炭處理紅色區(qū)域減少，綠色區(qū)域增多，其中T3 處理內(nèi)外的紅色覆蓋區(qū)域最少，說明該處理真菌豐度最低。

2.2 生物炭對馬鈴薯根際土壤真菌組成及其豐度的影響

圖2 不同處理根際土壤真菌物種系統(tǒng)發(fā)育進化樹

物種組成分析反映樣品在不同分類學水平上的群落結(jié)構(gòu)，4個處理馬鈴薯根際土壤的真菌共包含5個門、25個綱、62個目、120個科、201個屬和345個種。在門分類水平上，馬鈴薯根際土壤真菌包含子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、接合菌門（Zygomycota）、壺菌門（Chytridimycota）和球囊菌門（Glomcromycota）。由表2可知，在門分類水平上構(gòu)成馬鈴薯根際土壤的優(yōu)勢真菌群落為子囊菌門，相對豐度為86.86%～95.86%，平均為91.76%，其次為擔子菌門和接合菌門，壺菌門和球囊菌門的豐度不足1%，無法分類和鑒定的雜菌占2.74%。與對照（T1）相比，T2～T4處理降低了擔子菌門和接合菌門的豐度，T3～T4處理增加了子囊菌門的豐度。

統(tǒng)計各樣本在科分類水平上豐度＞1%的真菌群落，結(jié)果表明（表3），構(gòu)成馬鈴薯根際土壤的真菌優(yōu)勢群落主要有糞殼菌目Incertae sedis 23、子囊菌科、糞殼菌科、糞殼菌目Incertae sedis、小子囊菌科、蜘蛛菌科、毛殼菌科、叢赤殼科、毛球殼科、肉座菌目無法識別的科，占全部菌落的1.68%～27.10%。與對照（T1）相比，T2～T4處理糞殼菌目Incertae sedis 23、小子囊菌科、毛殼菌科、叢赤殼科占總數(shù)的比例明顯提高；子囊菌科、糞殼菌科、糞殼菌目Incertae sedis占總數(shù)的比例呈明顯下降趨勢。

表2 不同處理真菌在門分類水平上的豐度比較

2.3 生物炭對馬鈴薯產(chǎn)量的影響

如表4所示，不同生物炭添加量對馬鈴薯單株產(chǎn)量、單株結(jié)薯數(shù)、商品薯率影響較大。與對照（T1）相比，T3處理顯著提高了馬鈴薯單株產(chǎn)量，比對照提高106.3%；各處理均顯著提高了馬鈴薯單株結(jié)薯數(shù)，其中T4和T3處理較高，分別比對照顯著提高了79.3%和58.6%；商品薯率以T2和T3處理較高，分別比對照顯著提高了64.3%和65.4%。綜合產(chǎn)量指標，不同生物炭添加有利于馬鈴薯單株產(chǎn)量和商品薯率的提高，T3處理的增產(chǎn)效果最顯著。

表3 不同處理真菌在科分類水平上的豐度比較

表4 生物炭對馬鈴薯產(chǎn)量的影響

3 結(jié)論與討論

土壤微生物及其活性對于土壤功能至關(guān)重要。真菌是微生物的重要組成部分，在與宿主植物相互作用中扮演著重要的角色，在有機物質(zhì)分解、養(yǎng)分循環(huán)及交換過程中起著基礎(chǔ)作用。研究表明，生物炭處理土壤后，土壤真菌多樣性低于未處理土壤，接合菌門和球囊菌門數(shù)量增加，而擔子菌門和變型菌門的豐度卻有所降低（Jin，2010）；低溫（250 ℃）和高溫（650 ℃）條件下制備的生物炭都會降低土壤真菌多樣性，但會使一些細菌和放線菌的相對豐度增加（Khodadad et al.，2011）；土壤滅菌和生物有機肥聯(lián)用可使馬鈴薯根際土壤真菌群落多樣性指數(shù)較對照顯著下降5%～20%（劉星 等，2016）；通過翻耕連作馬鈴薯土壤30 cm和施用微生物菌劑，能夠顯著降低馬鈴薯耕層土壤真菌數(shù)量（謝奎忠 等，2013）；馬鈴薯隨連作年限的延長，土壤真菌比例逐漸上升（孫權(quán) 等，2010）。本試驗在土壤中添加不同量的生物炭，Chao1、Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)均呈下降趨勢，其中T3處理的Chao1指數(shù)比對照降低41.1%；土壤真菌物種系統(tǒng)發(fā)育進化樹表明，T3處理內(nèi)外的紅色覆蓋區(qū)域最少，綜合分析說明添加生物炭后，土壤真菌的豐富度或均勻度明顯下降，其中T3處理真菌豐度偏低，與前人研究結(jié)果相符（孫權(quán) 等，2010；Jin，2010；謝奎忠 等，2013；劉星 等，2016）。但也有研究表明，采用RAPD分子標記技術(shù)檢測，設(shè)施黃瓜輪作土壤的微生物群落均勻度、Shannon-Weaver 指數(shù)均比連作土壤高（吳鳳芝和王學征，2007）；通過黑土長期定位施肥、采用q-PCR分析結(jié)果表明，施用無機肥會提高土壤中真菌的數(shù)量，施用有機肥則減少土壤中真菌數(shù)量，而有機無機肥配施的真菌數(shù)量與不施肥處理無顯著差異（丁建莉 等，2017）。因此，有利的栽培措施能夠直接影響關(guān)鍵菌群的消減，還是通過影響真菌多樣性進而調(diào)控土壤養(yǎng)分循環(huán)，亟須進行深入分析。

本試驗中，馬鈴薯根際土壤真菌群落主要有子囊菌門、擔子菌門、接合菌門、壺菌門和球囊菌門，其中子囊菌門為優(yōu)勢種群，添加生物炭處理的豐度呈上升趨勢，擔子菌門和接合菌門則呈下降趨勢。有報道指出擔子菌中含有柄繡菌、黑粉菌等，能導致嚴重植物病害（李迅 等，2003）；子囊菌門叢赤殼科（Nectricaceae）菌多屬于菌生真菌，可以寄生病原真菌，該類菌群數(shù)量的增加可能具有抑制病原真菌的功能（莊文穎，2010）。本試驗中，土壤中添加生物炭后，擔子菌門數(shù)量呈下降趨勢，這可能會對植物生長有益；與對照相比，糞殼菌目Incertae sedis 23、小子囊菌科、毛殼菌科、叢赤殼科的豐度呈明顯上升趨勢，子囊菌科、糞殼菌科、糞殼菌目Incertae sedis的豐度呈明顯下降趨勢，與前人研究結(jié)果相似。有研究表明，生物炭的添加量為8 t·hm-2和20 t·hm-2時，玉米產(chǎn)量可提高71%和140%（Major et al.，2010）；生物炭的添加量為25.5～45.5 g·kg-1時，水稻生物量提高166%，果實產(chǎn)量提高294%，果實數(shù)量提高232%（Noguera et al.，2010）；生物炭的添加量為 10 t·hm-2時，小麥干質(zhì)量可以提高66.7%（van Zwieten et al.，2010）；1 200 kg·hm-2炭基肥對馬鈴薯田土壤容重、孔隙度和養(yǎng)分含量影響最佳，可作為陰山北麓地區(qū)馬鈴薯種植的推薦施肥量（焦瑞棗 等，2015）。本試驗中，每公頃添加20 t生物炭能夠顯著提高馬鈴薯單株產(chǎn)量、單株結(jié)薯數(shù)和商品薯率，分別比對照顯著提高106.3%、58.6%、65.4%，和其他研究存在不同生物炭添加量的區(qū)別，可能是由于生物炭成分不同或土壤肥力不同，從而導致產(chǎn)量增幅不同。