周 瑩 楊麗梅 劉 梅 黃金寶

（1北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所，北京 100097；2北京市大興區(qū)榆垡鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，北京 102602）

番茄黃化曲葉病毒病（Tomato yellow leaf curl disease，TYLCD）是世界范圍內(nèi)造成番茄嚴(yán)重減產(chǎn)的重要病害，由雙生病毒科（Geminiviridae）病毒侵染所致。番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）是番茄上發(fā)生很普遍的雙生病毒之一，隸屬于雙生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus）（Varsani et al.，2014），主要通過煙粉虱（Bemisia tabaci）傳播，可以侵染茄科、豆科等多種植物，基因組只含單組分的DNA-A，大小約2.8 kb，共編碼6個開放閱讀框（ORF）（Sondra & Lazarowitz，1992；Moriones &Navas-Castillo，2000）。TYLCV最早發(fā)現(xiàn)于中東以及地中海地區(qū)，1964年以色列就有其發(fā)生危害的報(bào)道（Cohen & Harpaz，1964）。隨著全球氣候變暖和耕作制度的改變以及國際貿(mào)易的增加，TYLCV在全球范圍傳播（Moffat，1999）。我國于2006年在上海首次發(fā)現(xiàn)（Wu et al.，2006），隨后從南向北擴(kuò)散流行（趙統(tǒng)敏 等，2007；余文貴 等，2009；周瑩 等，2010；金鳳媚 等，2011；熊艷 等，2011），2009年北京地區(qū)首次報(bào)道了TYLCD的發(fā)生（李明遠(yuǎn)，2009），后續(xù)的研究確認(rèn)了是由TYLCV引起（宋晰 等，2013；周瑩 等，2016）。該病毒引起的危害與侵染番茄植株的早晚直接相關(guān)，植株越早感染造成的損失越大，因此做好病毒檢測是病害防控工作中的一項(xiàng)重要環(huán)節(jié)。

TYLCV比較常用的檢測方法是基于血清學(xué)的酶聯(lián)免疫方法和基于PCR技術(shù)的分子檢測，血清學(xué)方法檢測植物病毒病具有直觀、方便等特點(diǎn)，但在靈敏度方面依賴于抗血清的品質(zhì)，在鑒別近緣病毒時有困難（季英華 等，2013；張偉 等，2013）。PCR分子檢測方法比血清學(xué)方法的靈敏度高，經(jīng)過預(yù)熱-變性-退火-延伸等熱循環(huán)過程來實(shí)現(xiàn)核酸的擴(kuò)增，是目前植物病毒常規(guī)的檢測方法之一。李常保等（2012）基于病毒基因組特異區(qū)段設(shè)計(jì)特異引物，達(dá)到TYLCV快速高效的分子檢測。等溫核酸體外擴(kuò)增是20世紀(jì)90年代出現(xiàn)的一種新型技術(shù)，這種技術(shù)是在恒定溫度下，通過一些特殊的蛋白（酶）雙鏈解螺旋，并促使特異性DNA片段擴(kuò)增，以達(dá)到核酸體外擴(kuò)增的效果。等溫核酸體外擴(kuò)增不需要高溫變性、退火和延伸等環(huán)節(jié)，核酸擴(kuò)增變得更加便捷，也擺脫了對核酸擴(kuò)增儀的依賴。重組酶聚合酶擴(kuò)增（recombinase polymerase amplifcafion，RPA）技術(shù)是近幾年發(fā)展起來最接近等溫的擴(kuò)增技術(shù)。在25～42 ℃范圍內(nèi)的等溫條件下，重組酶可與引物DNA緊密結(jié)合，形成酶和引物的聚合體，當(dāng)引物在模板DNA上搜索到與之完全互補(bǔ)的序列時，在單鏈DNA結(jié)合蛋白SSB的作用下，使模板DNA解鏈，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互補(bǔ)鏈。RPA產(chǎn)物與普通PCR一樣，為單一的擴(kuò)增產(chǎn)物。目前RPA技術(shù)在醫(yī)學(xué)病原物快速診斷中得到了一些應(yīng)用（樊曉旭 等，2016；吳耀東 等，2016），農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中主要用于轉(zhuǎn)基因作物的檢測（徐潮 等，2014；鄧婷婷 等，2015；劉靜 等，2018），植物病原物的檢測方面也有若干報(bào)道（魏梅生 等，2016；張娜 等，2016）。國內(nèi)尚未有RPA技術(shù)在番茄病毒檢測方面的報(bào)道，本文依據(jù)TYLCV基因組的保守序列，建立不依賴于復(fù)雜變溫儀器、操作簡單的TYLCV-RPA檢測技術(shù)，為蔬菜生產(chǎn)中TYLCV的田間調(diào)查和無毒苗的生產(chǎn)提供一種可選的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 植物樣品

試驗(yàn)于2017年3月至2018年3月在北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所植物病害防控研究室實(shí)驗(yàn)室完成。

感染番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）、番茄褪綠病毒（Tomato chlorosis virus，ToCV）的樣品和待檢測番茄樣品均采自北京海淀區(qū)和大興區(qū)，健康樣品為溫室網(wǎng)室中種植的番茄，所有樣品均經(jīng)PCR檢測和序列測定確認(rèn)后于-80 ℃保存。感染煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）和黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）的煙草材料由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑和儀器

植物DNA提取試劑盒、植物RNA提取試劑盒為TaKaRa公司產(chǎn)品，2×TaqDNA Master mix購于北京博邁德基因技術(shù)有限公司，TwistAmp Basic試劑盒（TwistDx）購于暢宇云商（北京）科技有限公司；主要儀器有Nanodrop核酸濃度測定儀、凝膠成像儀、電泳槽、金屬加熱浴等。

1.3 植物樣品總DNA和RNA的提取

樣品DNA和RNA分別使用植物核酸提取試劑盒提取，按照試劑盒說明書操作。

1.4 引物設(shè)計(jì)

參照番茄黃化曲葉病毒DNA-A基因序列（GenBank：KM506961.1），結(jié)合RPA引物設(shè)計(jì)的要求，設(shè)計(jì)1對RPA引物（表1）。引物由生工生物工程有限公司合成。

1.5 RPA方法的建立

1.5.1 RPA反應(yīng)體系 取1 μL DNA作為模板，依次加入ddH2O 13 μL，10 pmol·L-1的正反向引物各2 μL，干粉溶解緩沖液（rehydration buffer）29.5 μL，最后加入 280 mmol·L-1醋酸鎂 2.5 μL啟動反應(yīng)，總體積為50 μL，混勻后37 ℃孵育40 min。50 μL RPA產(chǎn)物與同體積的（Tri飽和酚∶氯仿=1∶1）混合，12 000 r·min-1離心10 min，吸取上清液5 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，20 min后染色拍照。

表1 用于檢測TYLCV的RPA引物

1.5.2 特異性測試 以ToCV陽性的番茄葉片、TMV和CMV陽性的煙草葉片RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn) 錄：dNTPs（2.5 mmol·L-1）3 μL，5×MMLV buffer 2 μL，MMLV（200 U·μL-1）1 μL，Rnaseinhibitor（40 U·μL-1）1 μL，隨機(jī)六聚引物和Oligo（dT）18 引物各0.5 μL，植物總RNA 1 μL，用滅菌ddH2O補(bǔ)足到20 μL，混勻后42 ℃溫育1 h獲得cDNA。將獲得的cDNA與TYLCV陽性樣品DNA各取1 μL進(jìn)行RPA反應(yīng)，同時設(shè)置健康樣品陰性對照。

1.5.3 靈敏度測試 將番茄黃化曲葉病毒陽性樣品DNA進(jìn)行濃度測定，做10倍梯度稀釋，用引物對F3/R3分別進(jìn)行RPA和普通PCR反應(yīng)，比較兩種方法的靈敏度。普通PCR反應(yīng)體系：2×TaqDNA Master mix 12.5 μL、F3和R3引物各1 μL、不同濃度的DNA模板1 μL、ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，60℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

1.5.4 樣品檢測 為了進(jìn)一步確定RPA-TYLCV檢測體系的可靠性，收集9個番茄樣品，其中7個樣品呈現(xiàn)葉片黃化皺縮的癥狀，有2個樣品未表現(xiàn)上述癥狀，以待測樣品DNA為模板，進(jìn)行RPA擴(kuò)增，同時以TYLCV陽性樣品和健康番茄樣品DNA作為陽性、陰性對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 RPA方法的特異性分析

特異性分析結(jié)果見圖1，除了TYLCV陽性樣品擴(kuò)增出343 bp的目的條帶外，ToCV、CMV、TMV陽性樣品和陰性對照均未出現(xiàn)條帶，表明建立的TYLCV RPA檢測方法具有很好的特異性。

2.2 RPA方法的靈敏度分析

經(jīng)Nanodrop核酸濃度測定儀測定，番茄樣品DNA濃度為50 ng·μL-1，10倍梯度稀釋后進(jìn)行RPA和普通PCR反應(yīng)，結(jié)果表明（圖2），RPA反應(yīng)的檢測靈敏度達(dá)到50 pg·μL-1，是普通PCR反應(yīng)的10倍。

2.3 樣品檢測

圖1 RPA方法檢測TYLCV的特異性

圖2 RPA和PCR法檢測TYLCV的靈敏度比較

圖3 采用RPA方法進(jìn)行TYLCV檢測

從圖3可以看出，9個待測番茄樣品中有7個與陽性對照都擴(kuò)增出目的條帶，2個樣品和陰性對照未擴(kuò)增出任何條帶，與7個樣品呈現(xiàn)葉片黃化皺縮的癥狀表現(xiàn)相符，說明建立的RPA方法能夠用于番茄樣品的TYLCV檢測。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)以番茄病毒病的病原番茄黃化曲葉病毒為靶標(biāo)，建立了RPA檢測方法。該方法操作簡單，反應(yīng)時間短，靈敏度高，只需1對引物，在37 ℃下反應(yīng)40 min即可達(dá)到高于普通PCR 10倍的擴(kuò)增結(jié)果，目的條帶為343 bp大小的特異性條帶；儀器要求簡單，僅需要1個恒溫裝置，水浴、金屬浴以及恒溫培養(yǎng)箱均可以滿足擴(kuò)增要求；方法特異性好，與番茄其他常見病毒無交叉反應(yīng)。該方法適合基層單位和現(xiàn)場檢測使用，為TYLCV的病害調(diào)查、田間診斷以及無毒苗木的生產(chǎn)提供了簡單高效的技術(shù)方法。

番茄黃化曲葉病毒是近幾年嚴(yán)重影響番茄生產(chǎn)的重要病毒病原，其引起的危害與感染時期相關(guān)，越早感染對生產(chǎn)造成的損失越大，因此做好檢測工作意義重大。核酸等溫體外擴(kuò)增是近幾年發(fā)展起來的核酸體外擴(kuò)增技術(shù)，與傳統(tǒng)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR相比，不依賴于溫度循環(huán)的特殊儀器，并且具有快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，逐漸顯示出其廣泛應(yīng)用的潛力。等溫核酸體外擴(kuò)增技術(shù)有多種形式，包括轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增（transcription mediated amplification，TMA）、鏈置換擴(kuò)增（strand displacement amplification，SDA）、依賴解旋酶擴(kuò)增（helicase-dependent amplification，HAD）、滾環(huán)擴(kuò)增（rolling-circle amplification，RCA）和環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增（loop-mediated amplification，LAMP）等（汪琳 等，2011）。早期的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在反應(yīng)條件、試劑儀器要求以及操作簡便性等方面存在一定的弊端。如TMA主要應(yīng)用于RNA擴(kuò)增，若檢測DNA則需要在循環(huán)相前對樣品進(jìn)行高溫變性，使其變成單鏈DNA。SDA、HDA、RCA及LAMP等均需在65 ℃下進(jìn)行退火，LAMP技術(shù)需要4條引物，引物設(shè)計(jì)比較復(fù)雜，除此之外，還需要較長的反應(yīng)時間和較高的反應(yīng)溫度。RCA和LAMP技術(shù)在植物病原物檢測中有部分報(bào)道（余玲玲 等，2008；秦文韜 等，2013）。RPA是目前最接近常溫的核酸擴(kuò)增技術(shù)，常溫下即可使核酸快速擴(kuò)增；而且在檢測時間上具有優(yōu)勢，整個擴(kuò)增反應(yīng)最短15 min即可完成，快于其他等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和普通PCR；此外，RPA引物設(shè)計(jì)雖沒有像傳統(tǒng)PCR引物那樣成熟，但經(jīng)過引物篩選和條件優(yōu)化可以建立起一套檢測技術(shù)。上述優(yōu)勢使得RPA技術(shù)在基層快速診斷上具有較大的發(fā)展空間。RPA技術(shù)作為一種新興檢測技術(shù)，還有需要完善的地方，如RPA擴(kuò)增體系中存在大量蛋白酶，所以擴(kuò)增產(chǎn)物必須除去蛋白之后才能進(jìn)行電泳或后續(xù)試驗(yàn)。本試驗(yàn)將RPA技術(shù)應(yīng)用到番茄病毒檢測中，擴(kuò)展了其使用范圍，后續(xù)將對檢測樣品的前處理方法進(jìn)行簡化，進(jìn)一步縮短檢測時間和提高檢測效率。