王寶石，李林波，譚鳳玲，付小敏，張明霞*

1(河南科技學(xué)院 生命科技學(xué)院，河南 新鄉(xiāng),453003) 2(現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 新鄉(xiāng),453003)

檸檬酸(citricacid)為無色、無臭顆粒粉末，具有強烈酸味，為動植物體內(nèi)的天然成分和生理代謝的中間產(chǎn)物，是一種非常重要的平臺化合物[1]，也是當(dāng)前世界上產(chǎn)量和消費量最大的食用有機酸[2]。檸檬酸主要合成方式為微生物發(fā)酵法，約有99%的產(chǎn)品是采用此方法生產(chǎn)[3]。因為絲狀真菌黑曲霉有酶系豐富、發(fā)酵效率高、副產(chǎn)物少等優(yōu)勢，所以在工業(yè)化生產(chǎn)中，超過80%檸檬酸產(chǎn)品是由黑曲霉液體深層發(fā)酵獲得[4]。但在液體培養(yǎng)體系中，其獨特的形態(tài)學(xué)特征會顯著影響產(chǎn)品的產(chǎn)量。因此，以黑曲霉為代表的絲狀菌形態(tài)學(xué)解析、塑造及其調(diào)控一直是現(xiàn)代工業(yè)發(fā)酵研究的熱點[5]。

1 菌絲球形成機理

在液體培養(yǎng)體系中，與細菌、酵母發(fā)酵過程相比，絲狀真菌黑曲霉呈現(xiàn)復(fù)雜的形態(tài)學(xué)特征，如高度游離的菌絲，菌絲纏繞疏松的菌絲團以及菌絲纏繞緊密的菌絲球[5]；在攪拌條件下的液體培養(yǎng)體系，更易產(chǎn)生非均相體系，影響耗氧發(fā)酵的兩個關(guān)鍵過程——溶氧(dissolvedoxygen)和傳質(zhì)過程(masstransfer)，進而影響菌體生長和發(fā)酵產(chǎn)率[6]。在檸檬酸工業(yè)化生產(chǎn)中，發(fā)酵菌種黑曲霉孢子擴大培養(yǎng)需要經(jīng)平板篩選、斜面培養(yǎng)、茄子瓶培養(yǎng)、麩曲桶培養(yǎng)等逐級擴大培養(yǎng)獲得成熟的孢子，如圖1所示，制備過程繁瑣且周期長(制備周期超過30d)；然后在液體培養(yǎng)體系中獲得成熟的種子。

圖1 工業(yè)化規(guī)模產(chǎn)檸檬酸黑曲霉的擴大培養(yǎng) Fig.1 Expanding cultivation of A. niger producing citric acid cultured in industrial scale

由于在連續(xù)培養(yǎng)過程中黑曲霉特殊的菌絲體結(jié)構(gòu)，會造成溶解氧運輸受到限制，進一步導(dǎo)致細胞代謝與檸檬酸合成異常，檸檬酸生產(chǎn)仍然以分批發(fā)酵模式存在，其能效較低，已成為檸檬酸產(chǎn)業(yè)提升的瓶頸。

絲狀真菌首先由休眠孢子吸水膨脹，逐漸萌發(fā)形成菌絲，菌絲進一步生長，形成大量的游離菌絲，游離菌絲相互纏繞形成菌絲球，圖2為產(chǎn)檸檬酸黑曲霉液體培養(yǎng)時的形態(tài)學(xué)特征。根據(jù)孢子在萌發(fā)初期的聚集特性，菌絲球形成機制可分為非凝集性(non-coagulatingtype)和凝集性(coagulatingtype)兩種類型[7]。非凝集型孢子的菌絲球形成會受到孢子濃度影響，低接種量會加速菌絲球形成。孢子聚集過程受到培養(yǎng)基組成、孢子活力、接種量以及機械攪拌因素的影響，主要發(fā)生在兩個階段:(1)接種后發(fā)生聚集，此過程僅受到滲透壓和pH值影響；(2)萌發(fā)后發(fā)生聚集，不僅受到滲透壓和pH值影響,還受到通氣和攪拌的影響。在絲狀真菌的液體培養(yǎng)體系中，只有準(zhǔn)確把握孢子聚集類型以及其接種量，才能準(zhǔn)確評估菌體的形態(tài)學(xué)特征。

圖2 產(chǎn)檸檬酸黑曲霉液態(tài)培養(yǎng)時的形態(tài)學(xué)特征 Fig.2 Morphological characteristics of A. niger producing citric acid when cultured in liquid culture

2 形態(tài)學(xué)分析

絲狀真菌形態(tài)學(xué)特征可分為微觀形態(tài)學(xué)特征和宏觀形態(tài)學(xué)特征。微觀形態(tài)學(xué)特征直接受到發(fā)酵環(huán)境的影響，它是宏觀形態(tài)學(xué)特征的外觀呈現(xiàn)。在液體培養(yǎng)體系中，菌絲團或菌絲球的培養(yǎng)形式，可以降低發(fā)酵液黏度，提高傳質(zhì)與溶氧過程，同時利于菌體與產(chǎn)品的分離；但菌絲球核心與營養(yǎng)物質(zhì)的運輸存在限制擴散，形成生產(chǎn)率下降的“盲區(qū)”[5]。在工業(yè)化生產(chǎn)中，游離菌絲狀的培養(yǎng)方式改善細胞生長速率與產(chǎn)率比較常見，但對于檸檬酸發(fā)酵生產(chǎn)來說，菌絲團或菌絲球更適合[8]。菌絲球的宏觀生長表現(xiàn)為菌絲球半徑的增加，但隨著菌絲球半徑的增加，發(fā)酵體系營養(yǎng)物質(zhì)至菌絲球內(nèi)部運輸受到限制，因此菌絲球存在臨界半徑[9]。精確界定菌絲球的臨界半徑，對于準(zhǔn)確控制發(fā)酵過程具有重要的意義。為了正確表征菌絲球的宏觀形態(tài)學(xué)特征，EMERSON[10]首先提出了菌絲球的生長模型-立方根定律，菌絲球殼芯的寬度恒定，殼芯生物量因底物限制而不參與生產(chǎn)過程，其生長僅發(fā)生在菌絲球殼外圍，以恒定的比生長速率生長，直至菌絲球臨界半徑。此模型的提出為定量分析絲狀真菌形態(tài)學(xué)特征奠定了基礎(chǔ)。

絲狀真菌形態(tài)學(xué)在發(fā)酵過程中扮演重要角色，無論菌體微觀形態(tài)(纖維狀結(jié)構(gòu))還是宏觀形態(tài)(菌絲球形態(tài))，均會影響檸檬酸發(fā)酵過程。正因為絲狀真菌菌絲體形態(tài)學(xué)的重要性，定量分析絲狀真菌形態(tài)的技術(shù)與手段，能夠為研究者提供精細的形態(tài)學(xué)特征資料，為深入理解形態(tài)學(xué)特征與產(chǎn)物合成速率提供了依據(jù)[8]。近年來，定量分析菌絲的微觀形態(tài)學(xué)取得了重要進展。如表1所示，熒光壽命成像技術(shù)(fluorescencelifetimeimaging,FLIM)定量分析了黃曲霉的熒光性能[11]；原子力顯微技術(shù)(atomicforcemicroscopy,AFM)，定量分析了黑曲霉(Aspergillusniger)[12-13]、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[14]及酵母細胞(Saccharomycescerevisiae)[15]的黏附力和力學(xué)性能；接觸角測量技術(shù)(contactanglemeasurement,CAM)，定量分析了構(gòu)巢曲菌(Aspergillusnidulans)[16]與近平滑念珠菌(Candidaparapsilosis)[17]的表面疏水性與黏附性；Zeta電位分析技術(shù)(zetapotential,ZP)，定量分析了黑曲霉(A.niger)孢子及其聚集體的靜電特性[18-19]。微觀形態(tài)學(xué)特征的發(fā)展，為深入理解絲狀菌的宏觀形態(tài)學(xué)特征提供了參考。

表1 菌體微觀形態(tài)學(xué)特征分析的研究進展Table 1 Research progress of microbial morphological characteristics

近年來，定量分析菌絲宏觀形態(tài)學(xué)也取得了重要進展，一些新興分析技術(shù)手段用于解析宏觀形態(tài)學(xué)特征，如表2所示。聚焦式激光反射技術(shù)(focused beam reflectance measurement, FBRM)，定量分析了黑曲霉顆粒弦長及其分布[20-22]；共聚焦激光掃描顯微技術(shù)(confocal laser scanning microscopy, CLSM)，定量分析黑曲霉的菌絲球表面特征、菌絲梯度分布及其蛋白表達區(qū)域定位[23-24]；激光衍射技術(shù)(laser diffraction technique, LDT)，定量分析了黑曲霉的折射率和散射強度[21, 25]；數(shù)字圖像分析技術(shù)(digital image analysis system, DIAS)，定量分析了菌絲頂尖生長、菌絲球形態(tài)及其數(shù)量，菌絲球最大直徑及其密度[26]。顆粒切片與沉降技術(shù)(pellet slicing and sedimentation, PSS)，定量分析了黑曲霉的菌絲球顆粒表面與內(nèi)部結(jié)構(gòu)及其沉降阻力[27]。微電極技術(shù)(microelectrode technique, MT)，定量分析了Penicilliumchrysogenum[28]，A.niger[29]，Aspergillusawamori[30]的溶氧濃度、滲透系數(shù)及其溶氧擴散深度。流式細胞技術(shù)(flow cytometry, FC)，定量分析了A.niger[31]，Bacillusanthracis[32-33]的菌絲球顆粒大小及密度分布，全細胞熒光活力。定量分析技術(shù)在絲狀菌宏觀形態(tài)學(xué)與微觀形態(tài)學(xué)的發(fā)展，為深入理解發(fā)酵過程形態(tài)學(xué)特征變化規(guī)律，在工程水平上精確調(diào)控菌絲體形態(tài)，提高發(fā)酵效率奠定基礎(chǔ)。

表2 菌體宏觀形態(tài)學(xué)特征分析的研究進展Table 2 Research advances in macroscopic morphological characteristics of strain

3 形態(tài)學(xué)工程

形態(tài)學(xué)分析手段的發(fā)展，為研究者在工程水平上控制菌絲特征提供了非常好的思路。環(huán)境條件會顯著影響絲狀菌的形態(tài)學(xué)特征[5]，表3展示了過程水平上控制菌體形態(tài)學(xué)特征的研究報道。通過調(diào)整孢子接種量及轉(zhuǎn)換pH的方法[8, 22, 37-39]，基于菌體生長與群體效應(yīng)，可以有效調(diào)控A.niger,Aspergillusoryzae,Aspergillusterreus,Rhizopusoryzae的形態(tài)學(xué)特征。通過調(diào)整通氣與攪拌條件，改變發(fā)酵體系機械能量輸入[40-43]。增加能量輸入，體積溶氧系數(shù)(kLa)與生物量，成功用于調(diào)控A.niger,R.oryzae,A.oryzae,Trichodermareesei,P.chrysogenum的菌絲球結(jié)構(gòu)，菌絲球濃度增加，進而提升了發(fā)酵效率?；谡{(diào)節(jié)滲透壓[44-47]，改變菌體的生理學(xué)特征，從而調(diào)整了A.niger的形態(tài)學(xué)特征。微粒包埋法[48-52]，包埋固定化菌絲體，可以有效控制顆粒直徑與濃度。形態(tài)學(xué)工程的蓬勃發(fā)展，為工業(yè)化控制絲狀菌的發(fā)酵過程提供了借鑒。

表3 基于過程水平控制絲狀菌形態(tài)學(xué)的研究進展Table 3 Research progress in controning fungal morphology on the process level

在黑曲霉發(fā)酵檸檬酸生產(chǎn)中，研究專家詳細分析了菌絲體的形態(tài)學(xué)特征，PAPAGIANNI[54-55]基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型將菌絲體分為游離菌絲、菌絲塊、菌絲球，并基于數(shù)字圖像分析技術(shù)(DIAS)分析了不同孢子接種量條件下的菌絲體形態(tài)特征，發(fā)現(xiàn)調(diào)整孢子濃度可以有效調(diào)節(jié)菌絲聚集狀態(tài)。在液體發(fā)酵體系中，攪拌對于改善溶氧與物質(zhì)傳遞是非常重要的，但劇烈攪拌會產(chǎn)生剪切力，會引起菌絲體形態(tài)學(xué)變化[56]。PAPAGIANNI[57-58]發(fā)現(xiàn)攪拌在不同發(fā)酵階段產(chǎn)生不同影響，在發(fā)酵初期劇烈攪拌會使菌絲高度分支化，產(chǎn)生菌絲碎片，而在發(fā)酵后期攪拌會使細胞老化，菌體衰亡。關(guān)于適合檸檬酸發(fā)酵的黑曲霉菌體形態(tài)學(xué)特征，不同研究專家存在不同的結(jié)果。PAUL[59]，LEE[60]研究發(fā)現(xiàn)菌絲體形態(tài)以游離菌絲存在時，菌體比生長速率與比產(chǎn)酸速率明顯高于菌絲球形態(tài)。KISSER[61]，GMEZ[62]研究發(fā)現(xiàn)，菌絲體形態(tài)為菌絲球時產(chǎn)酸量更高。盡管適合檸檬酸發(fā)酵生產(chǎn)的菌絲體形態(tài)特征存在爭議，但產(chǎn)酸較高的黑曲霉菌絲一般具有尖端多且膨大的特征，精確調(diào)控菌絲體形態(tài)有助于改善檸檬酸產(chǎn)量。

絲狀菌在復(fù)雜的液體培養(yǎng)體系中，更易受到機械攪拌與通氣等因素的影響，菌絲體形態(tài)呈現(xiàn)多樣性，呈現(xiàn)從高度游離的分散菌絲到菌絲纏繞緊密的菌絲球的形態(tài)。劇烈攪拌引起的剪切力會改變菌體形態(tài)學(xué)特征并產(chǎn)生菌絲碎片。BELMAR-BEINY[63]利用Streptomycesclavuligerus發(fā)酵克拉維酸時，發(fā)現(xiàn)高攪拌產(chǎn)生的菌絲碎片重新生長并合成產(chǎn)物；PAPAGIANNI[58]，PAUL[59]發(fā)現(xiàn)黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸時，機械剪切力能夠?qū)⒕z球表面的菌絲打散，形成的菌絲碎片會重新發(fā)育成菌絲球，如圖3所示。XIN等[42]提出了采用研缽將菌絲球磨碎成菌絲碎片，菌絲碎片在一定培養(yǎng)條件下會重新纏繞成菌絲球，并成功應(yīng)用于污水處理。上述絲狀真菌整個生命周期形態(tài)學(xué)特征的研究進展，為精確調(diào)控與有效利用絲狀真菌黑曲霉菌絲結(jié)構(gòu)提供了啟發(fā)；通過引入菌絲球分割技術(shù)，形成菌絲球—分散菌絲—菌絲球的循環(huán)模式，構(gòu)建絲狀真菌分割循環(huán)的新型發(fā)酵方式，可有效規(guī)避傳統(tǒng)分批發(fā)酵模式能效低的缺陷。

圖3 高速攪拌條件下的菌絲形態(tài)學(xué)特征Fig.3 Morphological characteristics of mycelium under high speed stirring

4 結(jié)束語

高產(chǎn)量、高轉(zhuǎn)化率、高生產(chǎn)強度統(tǒng)一為目標(biāo)的發(fā)酵工程技術(shù)，一直是現(xiàn)代工業(yè)發(fā)酵關(guān)注的焦點問題。本文以黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸為代表，多維度解析了絲狀菌在液態(tài)發(fā)酵體系中形態(tài)學(xué)特征及調(diào)控方法，并提出了基于現(xiàn)代儀器手段理解絲狀菌的微觀與宏觀形態(tài)學(xué)特征，通過引入菌絲球分割技術(shù)，建立基于形態(tài)學(xué)工程的控制手段，精確調(diào)控與有效利用黑曲霉菌絲結(jié)構(gòu)，進而建立適合檸檬酸發(fā)酵模式的形態(tài)學(xué)特征，為液態(tài)培養(yǎng)體系中絲狀真菌形態(tài)塑造及其新型發(fā)酵模式構(gòu)建提供一定參考。