劉怡雯，唐善虎，*，李思寧，宋凱紅

（1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都610041；2.四川新華西乳業(yè)有限公司，四川成都611732）

馬尿酸和苯甲酸普遍存在牛乳制品中，據(jù)報(bào)道馬尿酸含量為 30 mg/L～60 mg/L、苯甲酸為 0～22.7 mg/L[1]。有研究表明，牛乳在發(fā)酵形成酸奶過程中，乳酸菌能夠?qū)ⅠR尿酸轉(zhuǎn)化為苯甲酸，但此反應(yīng)不能逆向進(jìn)行[2]，從而導(dǎo)致酸奶中苯甲酸的含量高于普通乳制品。

目前苯甲酸及其鈉鹽是我國最常用的食品添加劑之一，GB 2760-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》給出了苯甲酸及其鈉鹽的安全使用范圍，但同時(shí)也規(guī)定了酸奶中不允許添加苯甲酸及其鈉鹽，并有研究表明，長(zhǎng)期攝入過量苯甲酸會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)興奮、腹瀉甚至可能會(huì)引發(fā)癌癥[3-4]。

牦牛是高海拔牧區(qū)的特色畜禽資源，其所產(chǎn)的牦牛奶富含豐富的氨基酸、鈣、鐵、鋅、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，相比普通牛奶，牦牛乳含有更高的功能性脂肪酸和蛋白質(zhì)，越來越受到人們的喜愛[5]。但由于高原牧區(qū)經(jīng)濟(jì)落后，牦牛乳長(zhǎng)期以來主要以自給自足的方式進(jìn)行生產(chǎn)，在生產(chǎn)過程中由于手工采集、器皿清潔的不達(dá)標(biāo)、較差的衛(wèi)生環(huán)境、質(zhì)量的不穩(wěn)定等因素導(dǎo)致其苯甲酸含量過高，限制了牦牛乳市場(chǎng)發(fā)展，導(dǎo)致其無法登上中國乳制品的主流銷售渠道[6]。為了保障牦牛酸乳品質(zhì)質(zhì)量和特性，打造地方特色產(chǎn)品品牌，更好地促進(jìn)地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和農(nóng)牧民增收致富，我們迫切地需要建立牦牛乳中馬尿酸轉(zhuǎn)化為苯甲酸動(dòng)態(tài)檢測(cè)的方法、制定牦牛酸奶中馬尿酸、苯甲酸的最高限量，從而保證人們的食品安全、提高牧區(qū)百姓的收入。

國外目前主要利用毛細(xì)管電泳[7]、氣相色譜[8]和液相色譜[9-14]等方法來檢測(cè)乳制品中馬尿酸、苯甲酸含量，但大部分方法主要集中于分開檢測(cè)兩種物質(zhì)，同時(shí)檢測(cè)兩種物質(zhì)的方法報(bào)道尚少。與此同時(shí)，國內(nèi)有關(guān)同時(shí)檢測(cè)馬尿酸和苯甲酸的食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)尚屬空白，相關(guān)研究也相對(duì)較少。高效液相色譜法是檢測(cè)馬尿酸和苯甲酸最為常用的方法之一，具有設(shè)備普及率高、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)成本低等特點(diǎn)[15-16]。鑒于以上研究，本文參考章唯[17]、趙貞等[18]學(xué)者在高效液相色譜對(duì)馬尿酸、苯甲酸同時(shí)檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，通過討論比較不同比例的流動(dòng)相、流速、沉淀劑等因素對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響情況，從而對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化選擇，建立一種更加快捷、靈敏度高、重現(xiàn)性好的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters2695高效液相色譜儀、TB-215D分析天平：北京賽多斯儀器系統(tǒng)公司；KQ5200DB超聲清洗器：中國曙峰企業(yè)；甲醇（色譜純）、乙酸（色譜純）、乙酸銨（色譜純）、草酸鉀（分析純）、磷酸氫二鈉（分析純）、乙酸鉛（分析純）、亞鐵氰化鉀（分析純）、乙酸鋅（分析純）、正己烷（分析純）：成都市科龍化工試劑廠；馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%）、苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%）：上海源葉生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 溶液的制備

草酸鉀-磷酸氫二鈉溶液：稱取草酸鉀15 g、磷酸氫二鈉35g，加少量水，充分?jǐn)嚢枞芙猓ㄈ葜?00 mL。

乙酸鉛溶液：稱取100 g乙酸鉛，加少量水，充分?jǐn)嚢枞芙?，定容?00 mL，配制成質(zhì)量濃度為200 g/L的溶液。

亞鐵氰化鉀溶液：稱取53 g亞鐵氰化鉀，加少量水，充分?jǐn)嚢枞芙猓ㄈ葜?00 mL。

乙酸鋅溶液：稱取109.5 g二合水醋酸鋅，加水溶解后，再加入16 mL冰乙酸，加少量水，充分?jǐn)嚢枞芙?，定容?00 mL。

乙酸銨溶液：稱取0.77 g乙酸銨，加水溶解，充分?jǐn)嚢枞芙?，定容?00 mL，配制成濃度為0.02 mol/L的溶液。

馬尿酸儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取0.0500g馬尿酸，用10mL甲醇溶解，加少量水，超聲充分溶解，定容至50 mL，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的馬尿酸溶液。

苯甲酸儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取0.0500g苯甲酸，用10mL甲醇溶解，加少量水，超聲充分溶解，定容至50 mL，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的苯甲酸溶液。

1.2.2 樣品處理

液固態(tài)樣品：準(zhǔn)確稱取樣品（5.00±0.05）g于試管中，待測(cè)。

乳粉樣品：準(zhǔn)確稱取樣品（3.00±0.05）g于試管中，加入10 mL 40℃左右溫水溶解，待測(cè)。

在上述準(zhǔn)備好的樣品中加入乙酸鉛溶液和草酸鉀-磷酸氫二鈉溶液各4 mL，渦旋1min，50℃超聲20 min，8 000 r/min離心10 min，取其上清液，加5 mL正己烷，渦旋1 min，8 000 r/min離心5 min，取其下清液轉(zhuǎn)入50 mL定容瓶中，加水定容，搖勻，上述溶液再經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，待液相色譜分析測(cè)定。

1.2.3 樣品沉淀劑的選擇

蛋白質(zhì)沉淀常用的方法有酸堿沉淀法、無機(jī)重金屬沉淀法和有機(jī)沉淀法[19]等。本試驗(yàn)選擇重金屬沉淀法來除去牦牛酸奶的蛋白質(zhì)。通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，本試驗(yàn)選擇亞鐵氰化鉀-乙酸鋅和乙酸鉛2種沉淀劑，通過比較其濾液澄清度、樣品回收率確定出最佳沉淀劑。

1.2.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

通過waters儀器二級(jí)管陣列檢測(cè)器對(duì)馬尿酸、苯甲酸在190 nm～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波段掃描，確定出最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.2.5 流動(dòng)相的選擇

通過查閱文獻(xiàn)可知，在馬尿酸和苯甲酸高效液相色譜法中有機(jī)相通常是甲醇，水相是乙酸和乙酸銨兩種物質(zhì)[19-20]。本試驗(yàn)將甲醇作為有機(jī)相，比較乙酸和乙酸銨兩種水溶液；通過分析討論馬尿酸、苯甲酸的檢測(cè)時(shí)間、分離效果、峰面積等因素比較乙酸和乙酸銨兩種水溶液，從而選擇出更適宜的水相。

1.2.6 流動(dòng)相的最佳比例

根據(jù)上述試驗(yàn)的結(jié)果，在流速1 mL/min、進(jìn)液量20 μL、馬尿酸和苯甲酸混合標(biāo)準(zhǔn)液濃度為1 μg/mL的條件下，探究流動(dòng)相的比例，確定流動(dòng)相的最佳比例，具體比例設(shè)定見表1。

表1 流動(dòng)相比例的設(shè)定Table 1 Setting of mobile phase ratio

1.2.7 流速的選擇

根據(jù)上述試驗(yàn)，在最佳流動(dòng)相比例的條件下，比較不同流速對(duì)馬尿酸、苯甲酸分離情況，選出最適宜的流速。具體設(shè)定見表2。

表2 流速的設(shè)定Table 2 Flow rate setting

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品沉淀劑的確定

本試驗(yàn)分析討論了樣品加標(biāo)后分別采用亞鐵氰化鉀-乙酸鋅和乙酸鉛—草酸鉀-磷酸氫二鈉溶液2種沉淀劑處理，其馬尿酸、苯甲酸的回收率及樣品過濾后澄清度情況，從而確定出最適宜的沉淀劑。具體數(shù)據(jù)見表3。

表3 不同沉淀劑處理樣品后馬尿酸、苯甲酸的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果Table 3 Result of rate of recovery and relative standard deviation（RSD）of hippuric acid and benzoic acid after treatment with different precipitators

由表3可知，加標(biāo)樣品選用乙酸鉛—草酸鉀-磷酸氫二鈉溶液處理后，其澄清度和回收率、精確度都普遍優(yōu)于用亞鐵氰化鉀-乙酸鋅溶液處理的樣品。（趙貞等[18]在利用高效液相色譜法檢測(cè)乳品中的馬尿酸和苯甲酸研究中，通過比較不同沉淀劑對(duì)樣品沉淀的效果也認(rèn)為乙酸鉛—草酸鉀-磷酸氫二鈉溶液的沉淀蛋白效果最佳。）祝偉霞等[20]在探討測(cè)定乳制品中苯甲酸和山梨酸含量的方法中選用乙酸鋅-亞鐵氰化鉀溶液作為沉淀劑，樣品加標(biāo)回收率為87.4%～110.0%。王淼等[21]建立的高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定乳及乳制品中苯甲酸、山梨酸、安賽蜜和糖精鈉的方法中利用亞鐵氰化鉀-乙酸鋅溶液作為沉淀劑，方法回收率在95.0%～103.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為1.70%～2.03%。祝偉霞和王淼等[20-21]得出的乙酸鋅-亞鐵氰化鉀處理后樣品加標(biāo)回收率普遍高于本試驗(yàn)苯甲酸的加標(biāo)回收率，這可能是由于牦牛酸乳的pH值跟普通牛乳存在差異所導(dǎo)致，考慮到亞鐵氰化鉀對(duì)眼睛、呼吸系統(tǒng)及皮膚有一定的刺激性并受熱分解，對(duì)檢測(cè)人員身體存在安全隱患，綜上所述，選擇乙酸鉛—草酸鉀-磷酸氫二鈉溶液作為樣品沉淀劑。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

經(jīng)waters儀器二級(jí)管陣列檢測(cè)器對(duì)馬尿酸、苯甲酸在190 nm～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波段掃描，為避免低波長(zhǎng)雜質(zhì)的干擾，本試驗(yàn)綜合考慮，選擇230 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。而章唯[17]在紅原牦牛乳制品中苯甲酸溯源分析研究中選擇的最佳檢測(cè)波長(zhǎng)為235 nm，這可能是由于不同的儀器和流動(dòng)相導(dǎo)致在不同波長(zhǎng)下馬尿酸和苯甲酸的響應(yīng)值略有不同。

2.3 流動(dòng)相的確定

本試驗(yàn)在有機(jī)相為甲醇，有機(jī)相與水相比例為50∶50（體積比）的條件下，0.4%乙酸溶液和 0.1 mol/L乙酸銨溶液分別為水相時(shí)，比較檢測(cè)物質(zhì)的檢測(cè)時(shí)間、檢測(cè)時(shí)間及峰面積，確定出最佳流動(dòng)相。具體數(shù)據(jù)見表4。

表4 不同流動(dòng)相的檢測(cè)結(jié)果Table 4 Detection results of different mobile phases

由表4可知選擇乙酸銨鹽類作為流動(dòng)相時(shí)，馬尿酸和苯甲酸的檢測(cè)時(shí)間為20 min，此外，每次上機(jī)前需要用高水相（10%甲醇）過濾沖洗，以避免造成堵塞，檢測(cè)周期準(zhǔn)備時(shí)間長(zhǎng)，不利于馬尿酸、苯甲酸的快速檢測(cè)；而選擇0.4%乙酸水溶液無需使用高水相進(jìn)行過濾沖洗，馬尿酸和苯甲酸檢測(cè)時(shí)間僅為15 min，且馬尿酸、苯甲酸的峰面積大小在不同流動(dòng)相下差異不明顯，且操作更加簡(jiǎn)單、檢測(cè)周期短。綜上所述，本試驗(yàn)確定將0.4%乙酸水溶液和甲醇作為流動(dòng)相。

2.4 流動(dòng)相的最佳比例

本試驗(yàn)在甲醇-0.4%乙酸水溶液作為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm，進(jìn)液量20 μL，馬尿酸、苯甲酸混合標(biāo)準(zhǔn)液濃度為1 μg/mL的條件下，通過單標(biāo)、混標(biāo)和空白對(duì)照的方式確定樣品中馬尿酸、苯甲酸的定性位置，采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，流速為1.0 mL/min，甲醇與0.4%乙酸水溶液的體積比從60∶40調(diào)整到40∶60，得到的結(jié)果見圖1。

由圖1A可知，當(dāng)流速為1.0 mL/min，甲醇∶0.4%乙酸水溶液=60∶40（體積比）時(shí)，馬尿酸出峰時(shí)間為3.26 min，苯甲酸出峰時(shí)間為5.49 min。該條件下馬尿酸出峰時(shí)間太早，與雜質(zhì)峰出峰時(shí)間接近，樣品峰將出現(xiàn)嚴(yán)重重疊，不適宜作為樣品的分析條件。

由圖1B可知，當(dāng)流速為1.0 mL/min，甲醇 0.4%乙酸水溶液=50∶50（體積比）時(shí)，馬尿酸出峰時(shí)間為3.89 min，苯甲酸出峰時(shí)間為8.57 min。該條件下馬尿酸出峰時(shí)間與雜質(zhì)峰基本分離，兩樣品峰完全分離，適宜作為樣品的分析條件。

圖1 流動(dòng)相的比例選擇Fig.1 Selection of the proportion of mobile phase

由圖1C可知，當(dāng)流速為1.0 mL/min，甲醇∶0.4%乙酸水溶液=40∶60（體積比）時(shí)，馬尿酸出峰時(shí)間為5.13 min，苯甲酸出峰時(shí)間為15.29 min。該條件下馬尿酸出峰時(shí)間與雜質(zhì)峰基本分離，兩樣品峰完全分離，但流動(dòng)相若水相比例較大的話，在大批量樣品處理過程中，對(duì)柱子的損傷較大，且隨著水相的增加，檢測(cè)時(shí)間有15 min增加到25 min，檢測(cè)周期加長(zhǎng)，故不適宜作為本試驗(yàn)樣品的分析條件。

綜上所述，本試驗(yàn)的流動(dòng)相最佳比例確定為甲醇∶0.4%乙酸水溶液=50∶50（體積比）。

2.5 流速的確定

本試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，流動(dòng)相為甲醇∶0.4%乙酸水溶液=50∶50（體積比），流速從1.0 mL/min調(diào)整到0.8 mL/min，得到的結(jié)果見圖2。不同流速下，馬尿酸和苯甲酸的平均峰面積值見表5。

圖2 不同流速下的峰面積Fig.2 Peak area at different velocities

表5 馬尿酸、苯甲酸的平均峰面積（±s）Table 5 Average peak area of hippuric acid and benzoic acid（±s）

表5 馬尿酸、苯甲酸的平均峰面積（±s）Table 5 Average peak area of hippuric acid and benzoic acid（±s）

流速/（mL/min）標(biāo)準(zhǔn)品（1 μg/mL）馬尿酸 苯甲酸1.0 72 619±106 114 196±118 0.9 77 278±68 120 424±89 0.8 90 399±97 142 381±103

通過比較馬尿酸、苯甲酸在不同流速下的平均峰面積可知，隨著流速降低，馬尿酸、苯甲酸的平均峰面積逐漸增大，峰寬增大?？紤]到峰型和試樣樣品成分復(fù)雜，為避免流速過低，雜質(zhì)可能無法不能完全沖出色譜柱從而導(dǎo)致色譜柱堵塞等因素，將本試驗(yàn)的流速確定為0.9 mL/min。

2.6 高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析

通過試驗(yàn)數(shù)據(jù)最終確定HPLC色譜條件為：測(cè)定波長(zhǎng)：230 nm；色譜柱：C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇 ∶0.4%乙酸水溶液=50 ∶50；流速：0.90 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣時(shí)間15 min。以此條件得到標(biāo)準(zhǔn)品和耗牛酸奶的HPLC圖見圖3和圖4。

由圖4可知，馬尿酸于4.33 min出峰，苯甲酸于9.52 min出峰。兩者出峰時(shí)間不同，馬尿酸、苯甲酸得到了很好的分離。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of standard products

2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立、線性范圍、檢出限

圖4 牦牛酸奶的HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of yak yoghurt

配制濃度為 0、2.5、5.0、10、25、50、100 μg/mL 的馬尿酸苯甲酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定峰面積，以峰面積對(duì)濃度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立線性方程：馬尿酸：y=10-5x+0.106 9；R2=0.999 9；苯甲酸：y=8-6x+0.256 8；R2=0.999 5。由此可知2種物質(zhì)的線性關(guān)系良好，R2均大于0.999。最低檢測(cè)濃度按3倍信噪比，進(jìn)樣20 μL計(jì)算，最低檢測(cè)限為 0.038 μg/mL，線性范圍 1 μg/mL ～100 μg/mL。謝國祥等[22]在乳制品中馬尿酸的檢測(cè)及其在發(fā)酵過程中的動(dòng)態(tài)變化研究表明在以C18為固定相，甲醇-水-醋酸體系為流動(dòng)相，最低檢出量為1.8 ng，最低檢出濃度為0.09 mg/kg。趙貞等[18]在高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)乳品中的馬尿酸和苯甲酸研究中，在C18反相色譜柱分離，以乙酸銨-甲醇溶液為流動(dòng)相條件下，按照信噪比RS/N=10計(jì)算得出，馬尿酸和苯甲酸的定量檢出限為1 mg/kg。屈莉等[15]在高效液相色譜法直接測(cè)定尿中馬尿酸的研究中，采用甲醇：磷酸鹽緩沖液（20∶80，體積比）為流動(dòng)相，流速0.8mL/min，PE4.6×150mm C18/5 μm柱分離，二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，方法檢出限為1.2 mg/L。由此可知，本試驗(yàn)建立的高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定牦牛酸乳中馬尿酸、苯甲酸的檢出限比之前相關(guān)學(xué)者建立的方法得出檢測(cè)限更低，對(duì)馬尿酸、苯甲酸在發(fā)酵過程中的動(dòng)態(tài)檢測(cè)將更加精準(zhǔn)。

2.8 回收率和精密度

發(fā)酵乳樣品中加入不同濃度的馬尿酸和苯甲酸，平行測(cè)定5次，每個(gè)樣品添加標(biāo)準(zhǔn)品后，渦旋10 s，放置10 min，再按提取凈化與測(cè)定的步驟進(jìn)行含量的測(cè)定，得出平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。具體結(jié)果見表6、表 7。

表6 發(fā)酵乳樣品的添加回收率結(jié)果Table 6 Results of added recovery of fermentation milk samples

由表6、表7可知，本方法測(cè)定馬尿酸平均回收率為96.79%～98.10%，RSD為0.58%～1.07%，苯甲酸平均回收率為93.54%～98.99%，RSD為0.71%～1.19%；對(duì)加標(biāo)的牛乳和發(fā)酵乳樣品平行測(cè)定5次，RSD值分別為0.58%和1.07%。章唯[17]在紅原牦牛乳制品中苯甲酸溯源分析中建立了高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)牦牛奶粉中馬尿酸和苯甲酸的方法，馬尿酸、苯甲酸的平均回收率為88.6%和92.23%。趙貞等[18]建立了高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)乳品中的馬尿酸和苯甲酸方法，該方法馬尿酸平均回收率為95.3%～97.7%，相RSD為0.37%～1.52%，苯甲酸平均回收率為102.7%～103.6%，RSD為0.57%～1.33%。綜上所述，本試驗(yàn)建立的方法在回收率、精確度和重現(xiàn)性上優(yōu)于章唯[17]學(xué)者建立的高效液相方法，雖然苯甲酸的回收率不及趙貞等[18]檢測(cè)的方法，但是差異不大，重現(xiàn)性更好。

表7 方法精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 7 Precision experiment results of the method

3 結(jié)論

本研究建立優(yōu)化了牦牛酸乳中馬尿酸和苯甲酸的 HPLC 檢測(cè)方法，在C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）為分離柱，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，進(jìn)液量為20 μL條件下，流動(dòng)相為甲醇與0.4%乙酸水溶液，其體積比為50∶50，流速為0.9 mL/min時(shí)，最低檢測(cè)限為0.038 μg/mL，在線性范圍1 μg/mL～100 μg/mL內(nèi)有良好的線性關(guān)系，R2＞0.999，尿酸平均回收率為96.79%～98.10%，RSD為0.58%～1.07%，苯甲酸平均回收率為93.54%～98.99%，RSD為0.71%～1.19%，馬尿酸和苯甲酸加標(biāo)樣品5次平行測(cè)定的RSD值分別為0.58%和1.19%。該方法檢測(cè)時(shí)間短、回收率和精密度高、檢出限低，為監(jiān)測(cè)牦牛乳制品中馬尿酸和苯甲酸的含量水平提供了一種可行的分析方法。