張婷，陳小偉，張沙沙，范昊安，薛淑龍，蔣立新，趙萬鈣，姚剛，蔡海鶯，*，毛建衛(wèi)，*

（1.浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江杭州310023；2.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州310023；3.浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江杭州310023）

木薯（拉丁名Manihot esculenta Crantz，英文名Cassava），為大戟科直立灌木，與甘薯、馬鈴薯并稱之為世界三大薯類。但木薯含有少量有毒氰化物，需有效的脫毒技術(shù)來降解甚至去除其毒性。比如采用水浸法對(duì)剝皮后的木薯塊根總生氰糖苷的去除率達(dá)到97.90%[1]，或通過蒸煮使木薯中生氰糖苷量降低80%[2]。甜木薯是木薯種類之一，其生氰糖苷含量極低，可供人安全食用。近年來木薯酸奶[3]、木薯餅干[4]、木薯面包[5]和木薯甜酒[6]等深加工產(chǎn)品層出不窮。據(jù)報(bào)道，黃發(fā)新等[7]以粗木薯粉為原料，以米曲霉作液化劑、黑曲霉作糖化劑及酒母作發(fā)酵劑釀造木薯白酒；袁子?jì)蒣8]以鮮木薯為原料加中草藥、調(diào)香花卉及甜酒曲釀造養(yǎng)生保健的木薯甜酒。木薯酒具有木薯特有的風(fēng)味，口感醇厚，老少皆宜，深受消費(fèi)者喜愛[6]。木薯酒的香氣直接影響其感官品質(zhì)，是反映其風(fēng)格的一個(gè)重要指標(biāo)[9]，但目前國內(nèi)外對(duì)木薯酒釀造工藝報(bào)道較多，對(duì)其香氣成分罕有研究。

本研究以甜酒曲、白酒曲分別對(duì)鮮木薯采取相同工藝進(jìn)行發(fā)酵，采用頂空-固相微萃取（headspace solid phase micro-extraction，HS-SPME）提取酒樣中香氣成分，并結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)分析，通過對(duì)比分析不同酒曲釀造木薯酒的主要香氣成分組成及相對(duì)含量的差異，為木薯酒的香氣特征研究提供科學(xué)依據(jù)，也為進(jìn)一步有效開發(fā)和利用木薯資源提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白肉甜木薯：采自廣西省防城港市的木薯基地；安琪風(fēng)味型甜酒曲、安琪白酒曲：安琪酵母股份有限公司。

乙醇（色譜純）：美國Sigma公司；葡萄糖、蒽酮、硫酸、氫氧化鈉、10%福林酚、甲醇（分析純）：國藥化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平（FA2004）：海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；紫外分光光度計(jì)（UV-5500PC型）：上海市元析儀器有限公司；精密酸度計(jì)（PHS-3C）：上海佑科儀器儀表有限公司；氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀（7890A-5975C）：美國安捷倫公司；手動(dòng)固相微萃取裝置（附帶57310-U，65 μm，PDMS/DVB萃取頭）：美國Supelco公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 木薯酒的工藝流程及操作要點(diǎn)

鮮木薯→清洗→去皮→切片→蒸煮→冷卻→加水打漿→拌曲發(fā)酵→過濾→高溫殺菌→成品

實(shí)驗(yàn)采用五折交叉驗(yàn)證法，將每個(gè)數(shù)據(jù)集等分五份進(jìn)行五次實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)記錄查全率和查準(zhǔn)率，并計(jì)算F-value數(shù)據(jù)，每個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行五次實(shí)驗(yàn)的F-value數(shù)據(jù)如圖2；其均值和標(biāo)準(zhǔn)差如表3所示，算法采用MATLAB編程實(shí)現(xiàn)。

制備過程中操作要點(diǎn)如下：

1）挑選無病蟲害，無霉?fàn)€的鮮木薯，先清洗干凈，后削皮，再切成8 mm～10 mm厚度的塊狀，進(jìn)行常壓蒸煮至無硬心而不爛，進(jìn)行軟化，蒸煮后冷卻至常溫。

2）按塊狀熟木薯∶去離子水=1∶2的質(zhì)量比進(jìn)行打漿。

3）熟木薯打漿液中按質(zhì)量比550∶0.5加入酒曲，發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵時(shí)間108 h，此時(shí)發(fā)酵液中上清液澄清且無氣泡產(chǎn)生。取3個(gè)平行酒樣，且酒樣于10 000 r/min條件下離心20 min，取上層清液置于-85℃超低溫冰箱儲(chǔ)存，待測(cè)。

1.3.2 木薯酒理化指標(biāo)測(cè)定

木薯酒中酒精度的測(cè)定采用國標(biāo)GB 5009.225-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)酒中乙醇濃度的測(cè)定》的第三法；總糖含量的測(cè)定采用蒽酮-硫酸法[10]；總酸含量的測(cè)定采用國標(biāo)GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的指示劑法；總酚含量的測(cè)定采用福林酚法[11]。

1.3.3 木薯酒的香氣成分提取

利用HS-SPME對(duì)不同酒曲發(fā)酵的木薯酒揮發(fā)性香氣成分進(jìn)行富集。準(zhǔn)確吸取1 mL不同酒曲發(fā)酵的酒樣，置于15 mL的固相微萃取樣品瓶中，加入0.5 g氯化鈉，以促進(jìn)香氣成分揮發(fā)，再加入磁力轉(zhuǎn)子，迅速用含有聚四氟乙烯隔墊的樣品蓋將樣品瓶密封，將樣品瓶置于固相微萃取工作臺(tái)上進(jìn)行50℃水浴平衡30 min，使氯化鈉充分溶解，待揮發(fā)性物質(zhì)與上部空氣、下部溶液互相平衡后，將已活化的萃取頭插入樣品瓶的頂空部位，推出萃取頭使其暴露于萃取瓶頂空中進(jìn)行萃取，萃取吸附30 min。當(dāng)樣品萃取平衡后，縮回纖維頭，吸附后的萃取針頭迅速插入氣相色譜（gas chromatography，GC）進(jìn)樣口，推出纖維頭于250℃解吸5 min，同時(shí)啟動(dòng)GC，分析酒樣并采集數(shù)據(jù)。

1.3.4 木薯酒的香氣成分分析

利用GC-MS測(cè)定2種酒曲發(fā)酵的木薯酒香氣成分種類及相對(duì)含量，對(duì)比分析其共同點(diǎn)及差別。

GC條件：DB-5MS色譜柱（50m×0.25mm×0.25μm）；進(jìn)樣口溫度為250℃；升溫程序?yàn)槌跏紲囟?0℃保持5 min，以5℃/min的升溫速度升到230℃后，保持10 min；傳輸線溫度為280℃；載氣為高純氦氣，其流速為1.0 mL/min；采用不分流模式進(jìn)樣。

MS條件：電離方式為電子轟擊離子源；電子能量70 eV；離子源溫度250℃；質(zhì)量掃描范圍30 amu～500 amu。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)中的檢測(cè)分析包括木薯酒的酒精度、總糖、總酸、總酚及香氣成分含量。對(duì)采集到的香氣成分質(zhì)譜圖通過計(jì)算機(jī)檢索，與NIST 08.L譜庫提供的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖對(duì)照以及人工解析進(jìn)行確認(rèn)，再結(jié)合保留時(shí)間等參數(shù)對(duì)部分組分進(jìn)一步確定。確認(rèn)各個(gè)揮發(fā)性風(fēng)味成分，并用EXCEL對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酒曲發(fā)酵的木薯酒理化指標(biāo)分析

對(duì)木薯酒進(jìn)行理化指標(biāo)測(cè)定，結(jié)果見表1。

由表1可知，白酒曲發(fā)酵的木薯酒比甜酒曲發(fā)酵的木薯酒中酒精度高、殘?zhí)橇康汀⑺岫雀?，總酚含量高?/p>

2.2 不同酒曲發(fā)酵的木薯酒中香氣成分GC-MS分析

經(jīng)GC-MS分析的總離子流圖見圖1、圖2。

表1 不同酒曲發(fā)酵的木薯酒理化指標(biāo)Table 1 Physicochemical indexes from different koji fermented cassava wine

圖1 甜酒曲發(fā)酵的木薯酒香氣成分的GC-MS總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of aroma components of cassava wine fermented with sweet wine koji

圖2 白酒曲發(fā)酵的木薯酒香氣成分的GC-MS總離子流圖Fig.2 Total ion chromatogram of aroma components of cassava wine fermented with spirits koji

由圖1、圖2可知在得到的揮發(fā)性物質(zhì)中，存在一些硅氧烷類等雜質(zhì)，它們并不是木薯酒中所存在的揮發(fā)性物質(zhì)，可能與萃取頭的表面材料有關(guān)。除此之外，從2種酒曲發(fā)酵后得到木薯酒鑒定的揮發(fā)性成分如表2所示。

從表2可知，2種酒曲發(fā)酵的木薯酒中共檢測(cè)出73種揮發(fā)性物質(zhì)，包括醇類14種、酯類25種、酸類5種、醛類7種、酮類3種、芳香類5種、烷烴類3種、胺類6種和醚類3種以及其他類2種。通過定性分析，木薯甜酒中檢測(cè)出揮發(fā)性成分的種類較多，共54種，而木薯白酒只有31種，其中共同的組分中醇類有3種、酯類6種、醛酮類2種、芳香類1種。不同酒曲發(fā)酵的木薯酒都各自含有不同的特有香氣成分。乙酸戊酯、2-甲基乙酸丁酯、2，6-二甲基-4-庚醇僅在木薯甜酒中檢測(cè)到，而乙酸苯乙酯、壬酸乙酯為木薯白酒所特有的揮發(fā)性成分。

表2 不同酒曲發(fā)酵的木薯酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析結(jié)果Table 2 Analysis of volatile compounds from different koji fermented cassava wine

續(xù)表2 不同酒曲發(fā)酵的木薯酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析結(jié)果Continue table 2 Analysis of volatile compounds from different koji fermented cassava wine

2.3 不同酒曲發(fā)酵的木薯酒揮發(fā)性香氣成分分析

從表2可知，木薯甜酒和木薯白酒中檢測(cè)出的揮發(fā)性成分的總相對(duì)含量皆高于80%，且兩者木薯酒的香氣成分中醇類和酯類占的相對(duì)含量較高，這說明在酒中醇類和酯類物質(zhì)是木薯酒香氣的重要組成成分。甜酒曲，白酒曲分別發(fā)酵的木薯酒中醇類、酯類、醛類、酮類及芳香類物質(zhì)的相對(duì)含量差別較為明顯，如白酒曲產(chǎn)醇能力較強(qiáng)，其發(fā)酵的酒樣中醇類物質(zhì)的相對(duì)含量比甜酒曲發(fā)酵的酒樣高26.48%，而甜酒曲產(chǎn)酯、產(chǎn)醛酮及產(chǎn)芳香類能力均為較高水平。醇類物質(zhì)在呈香上起主要作用，同時(shí)也是形成酯類物質(zhì)的前體[12]，而胺類、酸類、烴類、醚類及其他類等香氣成分在這兩種木薯酒中相對(duì)含量差異較小。

2.3.1 醇類香氣成分比較分析

醇類是構(gòu)成發(fā)酵酒香氣的主要物質(zhì)，主要是酵母在酒精發(fā)酵過程中利用氨基酸或糖代謝產(chǎn)生的次級(jí)產(chǎn)物[13-14]，對(duì)木薯酒品質(zhì)有重要影響。由表2所知：木薯發(fā)酵后的主要香味物質(zhì)為醇類，木薯甜酒、木薯白酒中共檢測(cè)出14種醇類化合物，其相對(duì)含量分別占總揮發(fā)性成分的86.93%、98.06%，共同含有的醇類有3種，分別是乙醇、異戊醇、β-苯乙醇，且其在木薯酒中的相對(duì)含量較高。這說明這3種醇類物質(zhì)是木薯酒的關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)，但在不同酒樣中的相對(duì)含量有所差異。白酒曲發(fā)酵的木薯酒中醇類物質(zhì)含量最高，這說明白酒曲總體產(chǎn)醇能力要優(yōu)于甜酒曲。少量醇類能夠賦予果酒優(yōu)雅的香氣，如乙醇具有令人愉快的香味；異戊醇具有淡雅細(xì)膩的花香和果香[15]，是木薯酒主體香氣成分之一。β-苯乙醇不僅具有良好的抗菌性能，且富有香味濃烈、持久的玫瑰花香和木香[15]。

2.3.2 酯類香氣成分比較分析

揮發(fā)性酯類是各大香氣化合物中的最重要組成，賦予葡萄酒或發(fā)酵飲料的主要果香味[16]，這極大影響酒的主體香型及風(fēng)格[17]。木薯甜酒、木薯白酒中共檢測(cè)出25種酯類化合物，其相對(duì)含量分別占總揮發(fā)性成分的11.10%、1.59%，說明甜酒曲的總體產(chǎn)酯能力要優(yōu)于白酒曲。相對(duì)含量較高的酯類物質(zhì)如丁二酸二乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯和辛酸乙酯，這些皆是2種木薯酒中共存的揮發(fā)性香氣成分。大多數(shù)酯類具有花、果香氣，對(duì)木薯酒的香氣質(zhì)量貢獻(xiàn)較大。如丁二酸二乙酯具有水果香和花粉香[18]，乙酸異戊酯具有蘋果香[18]，辛酸乙酯賦予木薯酒強(qiáng)烈的菠蘿果香與花香[19]。乙酸苯乙酯的相對(duì)含量較高，對(duì)木薯白酒的香氣貢獻(xiàn)較大。但苯乙酸乙酯和癸酸乙酯的相對(duì)含量較低，對(duì)木薯甜酒和木薯白酒的香氣貢獻(xiàn)較小。因此，酒曲的選擇會(huì)直接影響到木薯酒發(fā)酵所產(chǎn)生的酯類種類與相對(duì)含量，決定酒的香型。

2.3.3 酸類香氣成分比較分析

酸類是酵母微生物發(fā)酵的次級(jí)代謝產(chǎn)物[13]，是烷烴類化合物經(jīng)氧化而成的最終產(chǎn)物[20]，能保持酒體平衡和口感清爽的特征。適宜的含酸量能使酒帶有鮮水果香，能修飾酒滋味和口感，且有利于形成瓶貯酒香[21]。酸類成分和含量也受到微生物菌株的影響[22]。在木薯甜酒、中酸類香氣化合物只有1種，即2-氨基-5-甲基苯甲酸。而木薯白酒中酸類香氣化合物有4種，含量最高的是DL-蘋果酸。

2.3.4 醛及酮類香氣成分比較分析

酮類物質(zhì)可能因?yàn)槎嗖伙柡椭舅峤?jīng)熱氧化或降解，以及氨基酸降解或微生物氧化而產(chǎn)生的[23]。在木薯甜酒、木薯白酒中共檢測(cè)出醛、酮類物質(zhì)10種。甜酒曲所發(fā)酵的酒樣中苯乙醛、壬醛的相對(duì)含量高于白酒曲發(fā)酵的酒樣，且苯甲醛是甜酒曲所發(fā)酵的酒樣中所特有的香氣成分，同時(shí)苯甲醛含量的多少也造成了兩種木薯酒的醛類化合物總量的差距。木薯酒中醛酮類物質(zhì)的存在對(duì)其香氣有一定的貢獻(xiàn)，如苯甲醛具有杏仁香、櫻桃香及堅(jiān)果香[15]；苯乙醛能賦予木薯酒玫瑰花香，有先苦后甜的桃子味[24]；壬醛呈玫瑰花、青草味[18]。

3 結(jié)論

本文采用HS-SPME技術(shù)對(duì)不同酒曲發(fā)酵的木薯酒揮發(fā)性香氣成分進(jìn)行提取，并通過GC-MS對(duì)其進(jìn)行分析，2種酒曲發(fā)酵的酒樣中共鑒定出香氣成分73種，主要包括醇類、酯類、酸類、醛類、酮類、芳香族類、烷烴類、胺類和醚類等。甜酒曲和白酒曲發(fā)酵的木薯酒中共檢測(cè)出香氣成分54、31種，且共有的揮發(fā)性成分有12種。由分析可知，兩者酒樣香氣的差異主要表現(xiàn)在香氣成分組成和相對(duì)含量兩個(gè)方面。兩種木薯酒中相同的香氣成分有12種，其中含量最高的5種香氣成分依次為：乙醇、異戊醇、β-苯乙醇和丁二酸二乙酯。對(duì)應(yīng)的相對(duì)含量依次為：甜酒曲42.58%、15.08%、15.08%、3.19%，白酒曲70.41%、11.57%、10.55%、0.21%。由此可見木薯酒的主體揮發(fā)性成分為醇類及酯類化合物，這與Kang M等[18]對(duì)柑橘果酒的揮發(fā)性風(fēng)味化合物研究結(jié)果相似。主體香氣成分大部分相同說明三者使用相同原料釀造的酒在香氣成分組成上的一致性，而其相對(duì)含量以及各酒樣特有香氣成分的差異又說明木薯酒發(fā)酵時(shí)酒曲的不同對(duì)其香氣的形成具有重要作用。

不同酒曲發(fā)酵的木薯酒都各自含有不同的特有香氣成分。如乙酸戊酯、2-甲基乙酸丁酯、2，6-二甲基-4-庚醇僅在木薯甜酒中檢測(cè)到，而乙酸苯乙酯、壬酸乙酯為木薯白酒所特有的揮發(fā)性成分，且木薯白酒中未檢測(cè)到酮類，烷烴類。通常情況下，揮發(fā)性香氣化合物對(duì)酒總體風(fēng)味的貢獻(xiàn)由其種類、含量、香氣閾值及其相互協(xié)調(diào)作用共同決定，最終使木薯酒體現(xiàn)出特有的果香和發(fā)酵香等香氣特征，另外特征組分的鑒定還需人體嗅覺感官分析的協(xié)助或氣相色譜與嗅覺測(cè)量技術(shù)聯(lián)用等相關(guān)技術(shù)才能夠完成。