梁杰，趙曉旭，楊志強(qiáng)，汪少蕓

（1.莆田學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，福建省新型污染物生態(tài)毒理效應(yīng)與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建莆田351100；2.福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建福州350108）

海洋生物體內(nèi)存在許多珍貴的天然生物活性物質(zhì)[1]，因生活環(huán)境與陸地環(huán)境的巨大差異（低溫、高壓、高鹽度、避光、低氧）而具有結(jié)構(gòu)新穎、功能特殊的生物學(xué)特性[2-3]。各國科學(xué)研究者已經(jīng)從海洋動物、植物、微生物中分離出各種生物活性物質(zhì)[4-9]，其中一些已經(jīng)通過臨床驗(yàn)證并已成功上市，深受廣大消費(fèi)者喜愛和好評。鮑魚（abalone）貴為“海珍之冠”，是一種優(yōu)質(zhì)的動物蛋白，研究表明，其內(nèi)臟和肌肉中生物活性成分相似，含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、?；撬?、多糖等營養(yǎng)元素，具有抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫力及促進(jìn)皮膚膠原蛋白再生、維持生理代謝等保健功能，鮑魚內(nèi)臟（性腺）酶解物中氨基酸種類齊全，且具有良好的抗氧化能力，具有較高的研發(fā)價(jià)值[10]。由于海產(chǎn)品的生存環(huán)境，使其具有濃重的腥臭味，而這種令人厭惡的特征，影響水產(chǎn)蛋白酶解產(chǎn)物的開發(fā)應(yīng)用。酶解液中存在的苦腥味主要是由于酶解過程產(chǎn)生含疏水基團(tuán)的短肽和疏水性氨基酸，目前脫腥脫臭的方法主要為：物理吸附法、β-環(huán)糊精包埋法（β-Cyclodextrins，CDs）、酶法、微生物法、抗氧化劑法、萃取法、掩蓋法、微膠囊法、蒸氣脫腥法、酸堿處理法、高壓脈沖電場法等[11-12]。

本文在前期試驗(yàn)基礎(chǔ)上制備得到鮑魚內(nèi)臟粗蛋白，以抗氧化能力和水解度為指標(biāo)通過單因素和正交試驗(yàn)確定最佳酶解條件，得到具有較強(qiáng)抗氧化能力的酶解液；以食品級活性炭粉末為吸附劑，以蛋白質(zhì)回收率和感官評價(jià)為指標(biāo)，對酶解液進(jìn)行脫腥去苦工藝優(yōu)化（包括活性炭添加量、吸附時(shí)間、溫度等因素），確定最佳工藝參數(shù)。將水產(chǎn)品加工下腳料變廢為寶，制備抗氧化肽[13]，為提高鮑魚產(chǎn)品附加值和資源利用率提供了新思路，為推動海產(chǎn)品精深加工及開發(fā)相關(guān)保健品提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)原料

鮑魚內(nèi)臟：福建莆田城南市場。

1.1.2 試驗(yàn)試劑

木瓜蛋白酶：諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司；活性炭：萊陽市康德化工有限公司；其它化學(xué)試劑：國產(chǎn)分析純；試驗(yàn)過程用水：均為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

FD-1B-55型冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器公司；UV2550紫外/可見分光光度計(jì)：日本島津公司；DHG-9030A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏公司；MDF-U333型超低溫冰箱：日本三洋公司；PB-10型精密數(shù)顯酸度計(jì)：賽多利斯公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酶解工藝

1.3.1.1 酶解液的制備

鮑魚粗蛋白粉（冷藏）→加水?dāng)嚢柚镣耆芙狻罴衙附鈼l件，充分酶解→100℃下滅酶10 min→靜置冷卻后10 000 r/min速率離心分離10 min，取上清液→酶解液，待測。

1.3.1.2 水解度的測定

參照文獻(xiàn)[14-15]通過甲醛滴定法測定。

1.3.1.3 DPPH自由基清除率的測定

參照文獻(xiàn)[16]的方法測定DPPH自由基清除率。

1.3.1.4 單因素試驗(yàn)

參考文獻(xiàn)[17]并在前期大量探索試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以水解度和自由基清除率為評價(jià)指標(biāo)，分別考察酶/底物（[E]/[S]）（400、600、800、1 000、1 200、1 400、1 600、1 800 U/g）、底物濃度（1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%）、酶解時(shí)間（1.0、1.5、2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 h）、酶解溫度（30、35、40、45、50、55、60、65、70 ℃）、pH 值（分別調(diào)節(jié)為 4、5、6、7、8、9、10）等條件對酶解效果的影響，確定各因素的適宜范圍。

1.3.1.5 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，綜合考慮各因素之間的互相影響，選擇酶/底物（U/g）、酶解溫度（℃）、底物濃度（%）、pH值4個(gè)因素3個(gè)水平進(jìn)行優(yōu)化，做四因素三水平L9（34）的正交試驗(yàn)分析。因素水平表見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factor levels table of orthogonal test

1.3.2 脫腥除臭工藝

將食品級的活性炭粉末按一定比例加入酶解液中，充分?jǐn)嚢?，調(diào)節(jié)pH值，將其置于一定溫度水浴搖床中，吸附反應(yīng)一定時(shí)間，經(jīng)4 000 r/min離心10 min，測定上清液中蛋白質(zhì)回收率并進(jìn)行感官評定。在前期預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上并參考文獻(xiàn)[18]，以蛋白質(zhì)回收率和感官評定腥味值為指標(biāo)，通過活性炭添加量（0.25%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）、吸附時(shí)間（0、20、40、60、80、100、120min）、吸附溫度（10、20、30、40、50、60℃）等單因素進(jìn)行試驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化酶解液的脫腥脫臭工藝參數(shù)。因素水平表見表2。

表2 正交因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal test

1.3.2.1 蛋白質(zhì)回收率的測定

用凱氏定氮法分別測定酶解液經(jīng)活性炭吸附前和吸附后的蛋白質(zhì)含量，計(jì)算蛋白質(zhì)回收率。

式中：Pro1為脫腥液的蛋白質(zhì)含量，mg；Pro2為酶解液的蛋白質(zhì)含量，mg。

1.3.2.2 腥味感官評定方法

人類天生具有靈敏的嗅覺，能夠察覺分析儀器無法檢測的低濃度氣味物質(zhì)的存在，例如能覺察出在1 m3空氣中有4×10-5mg甲基硫醇，儀器卻無法檢測到[19]。在食品風(fēng)味研究中，感官評定是最簡單、直觀的方法，感官評分為最常用的方法。腥味感官評定由預(yù)先培訓(xùn)的10名固定的感官評定人員組成，采用先聞后嘗的方式，為不影響評定結(jié)果，測評過程中不允許交流和討論。分別對試驗(yàn)樣品的腥味、苦味、外觀顏色進(jìn)行綜合測評，以去離子水為對照（分值為0分），評分標(biāo)準(zhǔn)如表3 所示[19-20]。

表3 評分標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Standards for sensory evaluation

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳酶解條件的確定

多肽的抗氧化能力與水解度、分子量分布、氨基酸組成等因素密切關(guān)聯(lián)，研究酶解參數(shù)條件，如底物濃度、酶解溫度、酶/底物、酶解時(shí)間、pH值等因素，對于獲取具有較強(qiáng)抗氧化能力的活性肽至關(guān)重要[21]。前期試驗(yàn)提取得到鮑魚內(nèi)臟粗蛋白凍干粉。在前期大量試驗(yàn)摸索的基礎(chǔ)上，以水解度和抗氧化能力為指標(biāo)，選用木瓜蛋白酶為工具酶；以水解度（DH）和DPPH自由基清除率為評價(jià)指標(biāo)，分別考察底物濃度、酶解溫度、酶/底物、酶解時(shí)間、pH值對木瓜蛋白酶酶解效果的影響。

2.1.1 酶解條件單因素試驗(yàn)

酶/底物、底物濃度對酶解效果及DPPH自由基清除率的影響見圖1所示，酶解時(shí)間、酶解溫度、pH值對酶解效果及DPPH自由基清除率的影響如圖2所示。

圖1 酶/底物（A）、底物濃度（B）對酶解效果及DPPH自由基清除率的影響Fig.1 Effect of[E]/[S]（A），substance concentration（B）on eymohydrolysis and DPPH racial clearancing activity

2.1.1.1 酶/底物對鮑魚源抗氧化肽酶解效果的影響

圖2 酶解時(shí)間（A）、酶解溫度（B）、pH值（C）對酶解效果及DPPH自由基清除率的影響Fig.2 Effect of time（A），temperature（B），pH value（C）on eymohydrolysis and DPPH racial clearancing activity

由圖1（A）可知，隨著酶/底物的增加，酶解液水解度出現(xiàn)先增加后減小的趨勢，在酶/底物為400 U/g～1 200 U/g時(shí)，酶解液水解度不斷提高，在酶/底物即[E]/[S]為 1 200 U/g時(shí)水解度達(dá)到最大值（16.55±0.32）%；這是由于蛋白質(zhì)濃度一定的情況下，體系內(nèi)酶解效率隨著酶添加量的不斷增加而提高，酶解效率越高，則水解度也就相應(yīng)的越大，當(dāng)水解反應(yīng)進(jìn)行到一定程度，底物被飽和，酶的數(shù)量出現(xiàn)過剩的情況，此時(shí)水解速率幾乎保持穩(wěn)定的狀態(tài)。一般認(rèn)為，[E]＜＜[S]時(shí)，酶反應(yīng)速率與底物濃度呈正比關(guān)系，反應(yīng)到一定時(shí)間之后隨著[E]/[S]增加，水解度變化不明顯。DPPH自由基清除率隨著酶/底物增加不斷增大，當(dāng)酶/底物達(dá)到1 200 U/g時(shí)DPPH自由基清除率達(dá)到最大值（79.76±0.97）%，即酶解液抗氧化活力達(dá)到最大值；之后酶/底物繼續(xù)增加到1 800 U/g，DPPH自由基清除率出現(xiàn)下降的趨勢，該現(xiàn)象的產(chǎn)生可能是由于隨著酶解反應(yīng)的進(jìn)行，越來越多的蛋白被水解成小片段肽，DPPH自由基清除率不斷上升，而當(dāng)水解達(dá)到一定程度時(shí)，出現(xiàn)過度水解反應(yīng)導(dǎo)致部分具有抗氧化活性的肽段被酶解而失去抗氧化能力，且蛋白酶本身也是一種蛋白質(zhì)，自身發(fā)生酶促反應(yīng)干擾反應(yīng)體系；這與姚翔的研究相一致，他通過中性蛋白酶和氨肽酶酶解紫菜蛋白，酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率也隨著加酶量的增加先增大后降低[22]。綜上所述，以抗氧化能力為參考指標(biāo)，兼顧生產(chǎn)成本和水解度的因素，選擇酶/底物為1 200 U/g為最佳水平。

2.1.1.2 底物濃度對鮑魚源抗氧化肽酶解效果的影響

結(jié)果如圖1（B）所示，隨著底物濃度的增大水解度出現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在底物濃度為6%時(shí)達(dá)到最大為（14.41±0.56）%。這是因?yàn)榈孜餄舛容^小時(shí)底物蛋白過于分散，影響酶促反應(yīng)的進(jìn)行，使得酶解反應(yīng)效率較低，因此水解度在反應(yīng)開始階段呈現(xiàn)較低的情況；隨著底物濃度不斷增加，加快體系中生物大分子如蛋白質(zhì)和酶在水中的自由擴(kuò)散，促進(jìn)酶促反應(yīng)的有效進(jìn)行，水解度高；底物濃度過大，反應(yīng)體系的黏度液相應(yīng)變大，體系流動性差，造成底物蛋白與蛋白酶活性部位無法得到有效結(jié)合，使得底物蛋白與木瓜蛋白酶的接觸不夠完全，抑制酶解反應(yīng)的進(jìn)行[23]。當(dāng)?shù)孜餄舛葹?%～6%時(shí)，酶解液清除DPPH自由基的能力也不斷升高，在底物濃度為6%時(shí)清除率達(dá)到最大值（84.15±0.34）%，這是因?yàn)榈孜餄舛仍酱螅瑓⒓臃磻?yīng)的底物蛋白也越多，產(chǎn)生的抗氧化肽段比例也越高，所以抗氧化能力呈現(xiàn)上升的趨勢；當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到一定值時(shí)，酶解反應(yīng)能夠有效利用的酶均結(jié)合在反應(yīng)位點(diǎn)上，沒有多余的酶與底物蛋白相結(jié)合，此時(shí)即使不斷增加底物濃度，酶解液的抗氧化能力仍然維持在一定水平不再升高。劉丹用Alcalase堿性蛋白酶制備大豆抗氧化肽，底物濃度添加量與自由基清除率的關(guān)系也呈現(xiàn)一樣的變化趨勢[24]。綜上所述，選擇底物濃度6%為最佳用量。

2.1.1.3 酶解時(shí)間對鮑魚源抗氧化肽酶解效果的影響

由圖 2（A）可知，酶解時(shí)間為 1.0 h～5.0 h 時(shí)，水解度呈現(xiàn)不斷上升的趨勢，在3.5小時(shí)后水解度仍然呈上升趨勢但增幅開始減緩，這是因?yàn)殡S著酶解時(shí)間的增加，酶對專一性的肽鍵水解達(dá)到飽和，且隨著反應(yīng)的不斷進(jìn)行，底物濃度不斷減低，產(chǎn)物濃度不斷累積增加，酶的競爭性抑制趨于穩(wěn)定[25]。在酶解過程進(jìn)行到第4小時(shí)時(shí)，酶解液DPPH自由基清除率達(dá)到最大值（83.76±0.31）%，這可能與目的產(chǎn)物抗氧化肽被過度水解，導(dǎo)致具有抗氧化活性的肽段被切割而降低抗氧化能力有關(guān)。綜上所述，以DPPH自由基清除率為評價(jià)指標(biāo)，兼顧生產(chǎn)時(shí)間成本，選擇酶解時(shí)間為4.0 h為最佳酶解時(shí)間。

2.1.1.4 酶解溫度對鮑魚源抗氧化肽酶解效果的影響

結(jié)果如圖2（B）所示，隨著酶解溫度的升高，酶解液水解度也呈升高的趨勢，而DPPH自由基清除率在溫度達(dá)到40℃后則沒有顯著變化。在酶促反應(yīng)進(jìn)行過程中，溫度是影響較大的因素之一，溫度升高，反應(yīng)加快，因而水解度升高，溫度降低，反應(yīng)速度減慢。由圖2（B）可知，60℃為抗氧化能力最大時(shí)的酶解溫度。

2.1.1.5 pH值對鮑魚源抗氧化肽酶解效果的影響

結(jié)果如圖2（C）所示，隨著pH值增加酶解液水解度不斷升高，在pH值為8時(shí)達(dá)到最大值（15.01±0.55）%，pH值繼續(xù)增大，即溶液體系開始變?yōu)槠珘A性時(shí)，水解度出現(xiàn)下降。pH值為7是木瓜蛋白酶的最適pH值環(huán)境，此時(shí)水解度和抗氧化能力都尚未達(dá)到最大值。這是因?yàn)槊傅淖钸mpH值不是酶的特征物理常數(shù)，即不是一成不變的固定值，與酶和底物濃度、酶的作用時(shí)間、環(huán)境中pH值密切相關(guān)，酶與底物的結(jié)合和催化反應(yīng)常取決于底物和酶分子的電荷分布，酶活性受pH值影響較為顯著，蛋白質(zhì)的電荷分布是由氨基酸序列中可解離的側(cè)鏈狀態(tài)決定，而這又與pH值相關(guān)，過酸或過堿都會影響其活性。在pH值為8的條件下，該體系酶促反應(yīng)的效率最高，酶解液中抗氧化肽所占比例最大，此時(shí)DPPH自由基清除率為（85.67±0.92）%。綜上所述，選擇pH值為8酶解的最適pH值。

2.1.2 制備抗氧化肽的正交試驗(yàn)

分析單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取酶/底物（U/g）、底物濃度（%）、pH值、酶解溫度（℃）做四因素三水平L9（34）的正交試驗(yàn)分析，正交試驗(yàn)結(jié)果見表4，方差分析見表5。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果表Table 4 Orthogonal experiment and results

表5 方差分析表Table 5 Results of variance analysis

由表4中可知，4個(gè)因素中，對自由基清除率的影響主次排序?yàn)椋篊＞A＞D＞B，即影響抗氧化能力因素的主次順序?yàn)椋簆H值＞酶/底物＞酶解溫度＞底物濃度。通過正交優(yōu)化分析得到最優(yōu)組合為A1B1C3D2，正交表中實(shí)際自由基清除率最高的組合為A1B3C3D3，為獲得最佳的抗氧化能力活性肽片段并從實(shí)際生產(chǎn)中節(jié)約成本的原則出發(fā)，選取A1B1C3D2為最佳試驗(yàn)方案。由表5可知，因素pH值對自由基清除率的影響具有顯著性，酶/底物和底物濃度對自由基清除率的影響不顯著。綜上，本試驗(yàn)的優(yōu)化組合為A1B1C3D2，即pH值9，酶/底物1 000 U/g，酶解溫度60℃，底物濃度5%。

2.1.3 最佳條件的驗(yàn)證

控制反應(yīng)體系處于最佳條件下，測定該條件下酶解得到抗氧化活性肽其DPPH自由基清除率為（88.14±0.92）%，與正交表4中的結(jié)果對比，確為最高，因此該工藝為制備鮑魚抗氧化肽的最佳酶解條件。

2.2 脫腥脫臭工藝的優(yōu)化

鮑魚內(nèi)臟蛋白酶解液是具有良好抗氧化能力的多肽片段，該水溶性蛋白水解產(chǎn)物存在著海產(chǎn)品特有的較為濃郁苦腥味?；钚蕴渴且环N常見的疏水性吸附劑，本研究采用活性炭為脫腥劑，以蛋白質(zhì)回收率和感官評定腥味值為參考指標(biāo)，通過考察脫腥劑用量、吸附pH值、吸附時(shí)間、吸附溫度等單因素對脫腥脫臭效果的影響，旨在優(yōu)化水產(chǎn)品脫腥脫臭的工藝參數(shù)，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。

2.2.1 單因素試驗(yàn)

活性炭添加量、pH值對蛋白質(zhì)回收率和感官指標(biāo)的影響如圖3所示，溫度、吸附時(shí)間對蛋白質(zhì)回收率和感官指標(biāo)的影響如圖4所示。

2.2.1.1 活性炭質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

圖3 活性炭添加量（A）、pH值（B）對蛋白質(zhì)回收率和感官指標(biāo)的影響Fig.3 Activated carbon content（A），pH 值（B）influence on protein recuperation and sensory index

圖4 溫度（A）、吸附時(shí)間（B）對蛋白質(zhì)回收率和感官指標(biāo)的影響Fig.4 Temperature（A），Adsorption time（B）influence on protein recuperation and sensory index

活性炭質(zhì)量分?jǐn)?shù)對酶解液脫腥脫臭效果影響如圖3（A）所示，隨著活性炭添加量的增加，感官指標(biāo)分值隨著活性炭質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而降低，表明活性炭去苦腥味效果良好；由于活性炭對蛋白也有一定的吸附能力，造成蛋白質(zhì)回收率隨著活性炭質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而降低。為保證試驗(yàn)效果，既要腥味物質(zhì)和色素分子能被活性炭最大限度吸附，又要避免蛋白多肽等活性物質(zhì)被吸附造成物料損失，以蛋白質(zhì)回收率兼顧腥味感官值為指標(biāo)，活性炭添加量為1.0%時(shí)，蛋白質(zhì)回收率可達(dá)到（84.34±0.45）%，此時(shí)腥味值為4.40，腥苦味相對較小。綜上所述，本試驗(yàn)選擇活性炭添加量為1.0%為最佳水平，并選取1.0%、1.5%、2.0%為后續(xù)正交試驗(yàn)中活性炭質(zhì)量分?jǐn)?shù)因素的3個(gè)水平。

2.2.1.2 pH值的影響

吸附體系pH值對酶解液脫腥脫臭效果影響如圖3（B）所示，pH值對蛋白質(zhì)回收率和感官評分值的影響顯著，在酸性條件下，即pH值范圍在2～6時(shí)，活性炭對體系的脫腥脫臭效果較為理想，且蛋白質(zhì)回收率呈遞增的趨勢；當(dāng)體系pH值從中性緩慢過渡到堿性時(shí)，即pH值范圍在7～9時(shí)，蛋白質(zhì)回收率呈緩慢增大的趨勢，但活性炭的脫腥脫臭能力開始減弱，感官評定分值出現(xiàn)增加的情況。為兼顧蛋白質(zhì)回收率和腥味感官值兩個(gè)參考指標(biāo)，選擇吸附體系pH值6.0為最優(yōu)水平，該水平下感官評定分值為3.45，此時(shí)蛋白質(zhì)回收率可達(dá)（85.45±0.45）%。利用活性炭在體系酸堿性不同的條件下對色素的吸附和解析作用，可以循環(huán)利用活性炭[26]。綜上所述，本試驗(yàn)選擇pH 6.0為最佳水平。

2.2.1.3 吸附溫度的影響

吸附溫度對活性炭脫腥脫臭效果影響如圖4（A）所示，在10℃～40℃時(shí)，感官評定分值呈遞減的趨勢，表明升高溫度能夠促進(jìn)活性炭吸附酶解液中的色素分子，此時(shí)蛋白質(zhì)回收率也呈遞增的趨勢，當(dāng)溫度為40℃時(shí)，蛋白質(zhì)回收率為（88.13±0.32）%，此時(shí)腥味感官值最低，為3.61；當(dāng)溫度升高到60℃時(shí)，蛋白質(zhì)回收率僅剩（70.25±0.47）%，此時(shí)腥味值也呈增大趨勢；綜合考慮，既要腥味物質(zhì)和色素分子被活性炭吸附，同時(shí)要避免蛋白多肽等活性物質(zhì)被吸附造成物料損失，同時(shí)考慮能耗因素，選擇吸附溫度為40℃為最佳水平，并選取30、40、50℃為后續(xù)正交試驗(yàn)中溫度因素的3個(gè)水平。

2.2.1.4 吸附時(shí)間的影響

如圖4（B）所示，當(dāng)吸附時(shí)間在0～80 min時(shí)，蛋白質(zhì)回收率隨時(shí)間延長呈降低趨勢，當(dāng)時(shí)間為80 min～120 min時(shí)，活性炭吸附劑的對蛋白質(zhì)的吸附開始趨于飽和，當(dāng)時(shí)間為120 min時(shí)，蛋白質(zhì)回收率僅剩下（77.44±0.98）%；當(dāng)吸附時(shí)間為 0～60 min時(shí)，腥味感官值呈現(xiàn)降低的趨勢，在60 min時(shí)腥味感官值達(dá)到最低值2.81，時(shí)間繼續(xù)延長，此時(shí)感官腥味值受時(shí)間的影響趨于不明顯。綜上所述，考慮時(shí)間成本，選擇吸附時(shí)間為60 min為最佳水平，并選取40、60、80 min為后續(xù)正交試驗(yàn)中時(shí)間因素的3個(gè)水平。

2.2.2 活性炭吸附正交試驗(yàn)結(jié)果

分析單因素試驗(yàn)，選取活性炭質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH值、吸附溫度3個(gè)因素進(jìn)行L9（34）正交優(yōu)化試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果及分析分別見表6、表7、表8。

表6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 The orthogonal design and results of anthrasorb odor treatment

表7 方差分析表（以蛋白質(zhì)回收為指標(biāo)）Table 7 Analysis of variance table（protein recuperation）

對因素C而言，它對感官值的影響最重要，故選因素C的第二水平，即C2；對因素B而言，選第一水平時(shí)其蛋白質(zhì)回收率較低，最高僅為81.65%，而當(dāng)選第二水平時(shí)，蛋白質(zhì)回收率最高可達(dá)88.43%，故選因素B的第二水平，即B2；對因素A而言，它對蛋白質(zhì)回收率的影響最重要，對感官值的影響次序排第二，當(dāng)選因素A的第一水平時(shí)，蛋白質(zhì)回收率最高可達(dá)88.57%，而選因素A的第二水平時(shí)，蛋白質(zhì)回收率最高僅為83.11%，綜合考慮，因素A選取第一水平為最合適，即A1。

表8 方差分析表（以感官值為指標(biāo)）Table 8 Analysis of variance table（sense evaluate）

由方差分析表7、8可知，活性炭質(zhì)量分?jǐn)?shù)對蛋白質(zhì)回收率影響顯著，吸附溫度對蛋白質(zhì)回收率的影響不顯著，歸入誤差項(xiàng)；吸附溫度對腥味值的影響極顯著，活性炭質(zhì)量分?jǐn)?shù)對腥味值的影響較顯著，吸附時(shí)間對腥味值的影響不顯著，歸入誤差項(xiàng)。

綜上，本試驗(yàn)優(yōu)化后的因素組合為A1B2C2，即食品級粉末活性炭的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%，吸附時(shí)間為60min，吸附溫度為40℃。在該條件下試驗(yàn)得到的蛋白質(zhì)回收率為（88.06±0.24）%，腥味值為 2.00。

3 結(jié)論

鮑魚內(nèi)臟蛋白通過木瓜蛋白酶充分酶解，以抗氧化能力和水解度為指標(biāo)進(jìn)行單因素和正交試驗(yàn)得到最佳酶解條件：pH值9，酶/底物1 000 U/g，酶解溫度60℃，底物濃度5%，該條件下酶解得到抗氧化活性肽其DPPH自由基清除率為（88.14±0.92）%，酶解液水解度為（14.12±0.53）%。海產(chǎn)品酶解液本身具有令人厭惡的苦腥味，因此選擇食品級活性炭粉末作為吸附劑進(jìn)行脫腥脫臭，以蛋白質(zhì)損失率和感官評定為指標(biāo)，得到活性炭最佳吸附工藝參數(shù)為：活性炭質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%，吸附時(shí)間60 min，吸附溫度40℃，該條件下得到蛋白質(zhì)回收率為（88.06±0.24）%，腥味值為2.00，此時(shí)酶解液無明顯苦腥味，液體澄清呈淡黃色，感官品質(zhì)顯著改善。