許丹，方益，何鵬飛，嚴(yán)忠雍，黃麗英，張小軍

（浙江省海洋水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部重點漁場漁業(yè)資源科學(xué)觀測實驗站，浙江省海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用技術(shù)研究重點實驗室，浙江舟山316021）

南極磷蝦（Euphausia superba）主要分布于南極洲水域，屬于高緯度低溫條件下生長的冷水蝦類，儲量巨大，全球資源的總量預(yù)估6.5億噸～10億噸，每年捕撈量達到4 500萬噸～1億噸，是全球重要的蛋白質(zhì)資源之一[1-2]。南極磷蝦營養(yǎng)豐富，具有低脂肪、高蛋白的特點，蛋白含量可占全蝦鮮重的16.04%～17.81%，含有人體所需的全部氨基酸，8種必需氨基酸含量較高[3]，其中賴氨酸含量遠遠高于金槍魚、南美白對蝦和牛肉的含量[4]。此外，其富含多種不飽和脂肪酸，約占總脂類含量的49.1%～67.6%，其中DHA和EPA所占比例為89.2%和79.1%[5]；全蝦中鈣、鉀、鎂等多種礦物質(zhì)元素含量為3.37%，磷蝦肌肉中含量為2.36%[3]，除上述營養(yǎng)物質(zhì)外，南極磷蝦體內(nèi)的類胡蘿卜素量較高，尤其是眼球部，約占總量的25%[6]。由于南極磷蝦所含營養(yǎng)價值較高，在加工上存在著巨大潛力，近年來受到越來越多研究人員的關(guān)注[3，7]。

對于食品而言，風(fēng)味質(zhì)量包括揮發(fā)性成分和非揮發(fā)性成分兩個方面。揮發(fā)性成分決定了食品的氣味特征，而非揮發(fā)性成分不僅影響食品的滋味，還是絕大多數(shù)揮發(fā)性成分的前體物質(zhì)，對食品風(fēng)味的產(chǎn)生有著十分重要的作用，主要包括含氮化合物（游離氨基酸、呈味核苷酸及其關(guān)聯(lián)化合物、甜菜堿、短肽）和不含氮化合物（有機酸、糖原、無機離子）等[8]。

目前南極磷蝦資源的研究多集中于酶解工藝、酶解液美拉德反應(yīng)工藝及揮發(fā)性物質(zhì)分析等方面，而南極磷蝦酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中非揮發(fā)性物質(zhì)的相關(guān)研究很少。因此，本試驗以南極磷蝦酶解液為原料，與木糖進行美拉德反應(yīng)，利用理化分析法對美拉德反應(yīng)前后的呈味成分，包括含氮化合物和不含氮化合物進行分析，研究美拉德反應(yīng)對南極磷蝦酶解液中非揮發(fā)性物質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南極磷蝦：由作業(yè)船在南極海域捕撈，捕撈后迅速保存在-30℃冰柜中，冷凍方式運到實驗室，貯藏于超低溫冰箱中備用。

動物蛋白水解酶（2×105U/g）、風(fēng)味蛋白酶（1×105U/g）：食品級，諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司；D-木糖：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：邦西儀器科技（上海）有限公司；AL204電子天平：瑞士梅特勒-托利多公司；DHG-9123A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；PT-10 pH計：美國Sartorious公司；LG10-2.4A高速離心機：北京醫(yī)用離心機廠；W205B電熱恒溫水浴鍋：上海申勝生物技術(shù)有限公司；UV-3100紫外-可見分光光度計：上海美普達儀器有限公司；SYKAM S-433D全自動氨基酸分析儀：德國SYKAM公司；SC-80C全自動色差計：北京康光光學(xué)儀器有限公司；7900ICP-MS等離子體電感耦合質(zhì)譜儀：美國安捷倫公司；ACQUITY UPLC I-Class-XEVOTQS超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國waters公司；CP3380氣相色譜儀：美國瓦里安公司。

1.2 方法

1.2.1 南極磷蝦酶解液的制備

稱取一定量的南極磷蝦，加入1∶3（料液比，g/mL）水勻漿，于50℃和自然pH值下進行復(fù)合酶酶解，其中復(fù)合酶為動物蛋白水解酶和風(fēng)味蛋白酶（1∶1，質(zhì)量比），添加量為1 000 U/g，酶解3 h后于100℃下滅酶15 min，冷卻，離心去沉淀，乙酸鈣脫氟后即為南極磷蝦酶解液（Euphausia superba hydrolysate，EsH）。

1.2.2 南極磷蝦酶解液的美拉德反應(yīng)

取EsH 60 mL，加入20 g/L木糖，于100℃反應(yīng)60 min，即為南極磷蝦酶解液的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物（Euphausia superba hydrolysate-Maillard，EsH-M）。

1.2.3 褐變程度的測定

將EsH稀釋5倍，EsH-M稀釋20倍，于420 nm處測定吸光值。

1.2.4 色差的測定

用色差計分別測定EsH、EsH-M的L、a、b值。以EsH為對照，計算其色差ΔE，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

1.2.5 游離氨基酸的分析

各取5 mL EsH和EsH-M，分別加入等體積10%三氯乙酸，沉淀過濾，取濾液各稀釋20倍，采用SYKAM S-433D全自動氨基酸分析儀進行分析。

1.2.6 肽分子量分布的分析

將EsH、EsH-M各稀釋20倍后，0.22 μm濾膜過濾。采用超高效液相色譜儀測定。色譜柱：CSH C18 130A（2.1 mm× 100 mm，1.7 μm）；柱溫：40℃；流動相 A為水，B 為乙腈；進樣體積 10 μL；檢測波長：214 nm。分子量校正曲線所用標(biāo)準(zhǔn)品為細胞色素C、抑酚酶、桿菌酶、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸。

1.2.7 無機離子含量的測定

Na+和K+含量采用火焰原子吸收分光光度法（GB 5009.91-2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中鉀、鈉的測定》）；Ca2+含量采用火焰原子吸收分光光度法（GB 5009.92-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中鈣的測定》）；Mg2+含量采用火焰原子吸收分光光度法（GB 5009.241-2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中鎂的測定》）。

1.2.8 脂肪酸組成的測定

樣品前處理：采用酸水解-提取法，各取EsH、EsH-M 5 mL，加入焦性沒食子酸0.1 g，95%乙醇2 mL，蒸餾水4 mL，8.3 mol/L 鹽酸 10 mL，于 80℃水浴 40 min，水解完成后，取出冷卻至室溫。脂肪提取及之后步驟，參照GB 5009.168-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪酸的測定》操作。

色譜條件：DB-WAX 柱（30 m×0.32 mm，0.5 μm）；檢測器溫度：240 ℃；進樣體積 1 μL；分流比 20 ∶1；流速1.5 mL/min；升溫程序：80℃保持3 min，然后以5℃/min的速度升至120℃，保持5min，接著以2℃/min的速度升至180℃，保持50 min，再以1℃/min的速度升至240℃，保持60 min。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS18.0軟件中Duncan法進行各組之間的顯著性分析，采用Origin8.0對數(shù)據(jù)進行繪圖。樣品中脂肪酸、肽分子量結(jié)果分析采用峰面積歸一化法計算出各個脂肪酸的相對百分含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 美拉德反應(yīng)對酶解液褐變程度和色差的影響

褐變程度是檢測美拉德反應(yīng)進程的一個重要指標(biāo)，常用420 nm處的吸光值來表示，A420nm值增加表明美拉德反應(yīng)最后階段類黑素的產(chǎn)生。

美拉德反應(yīng)對酶解液褐變程度和色差的影響見表1。

表1 美拉德反應(yīng)對酶解液褐變程度和色差的影響Table 1 Changes in browning and chromatic aberration before and after Maillard reaction

由表1可知，EsH-M中A420nm明顯大于EsH，增加了0.57倍。有研究表明[9]，美拉德反應(yīng)高級階段，糖類物質(zhì)裂解生成酮、醛類等無色小分子中間產(chǎn)物，該類產(chǎn)物自身或相互間會聚合生成類黑精等大分子褐色物質(zhì)，使體系呈現(xiàn)出顯著的顏色特征。此外，顏色是美拉德反應(yīng)一個非常重要而又直觀的反映指標(biāo)，褐變反應(yīng)開始為淺黃色，最終變?yōu)樯詈稚玔10]，從表1中還可以看出，美拉德反應(yīng)的發(fā)生，使L值下降，向黑度方向偏移；a值和b值都顯著性升高，a值向紅色方向偏移，b值向黃色方向偏移，尤其以b值變化最為明顯。這說明加熱使體系發(fā)生了美拉德反應(yīng)并生成了有色物質(zhì)，導(dǎo)致顏色加深，并且a值和b值偏移的方向符合美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的顏色，此結(jié)果與程恒等[11]的研究結(jié)果相一致。

2.2 美拉德反應(yīng)對酶解液中氨基酸組成的影響

氨基酸（尤其是游離氨基酸）是美拉德反應(yīng)的重要底物，美拉德反應(yīng)前后酶解液中游離氨基酸含量如表2所示。

表2 美拉德反應(yīng)對氨基酸組成的影響Table 2 Changes in free amino acid before and after Maillard reaction

續(xù)表2 美拉德反應(yīng)對氨基酸組成的影響Continue table 2 Changes in free amino acid before and after Maillard reaction

由表2可知，EsH中共檢測出17種游離氨基酸，總量為3.18 g/100 g干物質(zhì)，美拉德反應(yīng)后，游離氨基酸總量損失8.49%。EsH游離氨基酸中含量較高的5種氨基酸為谷氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸和精氨酸，其中谷氨酸的含量最為豐富，約占游離氨基酸總量的18.52%；呈鮮味氨基酸主要為天冬氨酸和谷氨酸，分別占游離氨基酸總量的11.73%和18.52%；組氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸為苦味氨基酸，約占游離氨基酸總量的30.69%；精氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸和脯氨酸既帶有苦味，又帶有甜味，約占游離氨基酸總量的22.07%。經(jīng)美拉德反應(yīng)后，EsH-M損失最多的6種氨基酸分別為亮氨酸、精氨酸、組氨酸、異亮氨酸、半胱氨酸，損失率分別為34.18%、16.75%、16.67%、16.10%、12.37%，發(fā)現(xiàn)此5種氨基酸多為苦味氨基酸，表明美拉德反應(yīng)能改良酶解液的苦味。此外，脯氨酸含量增加了25.00%，這可能是反應(yīng)過程中，其他氨基酸經(jīng)過轉(zhuǎn)化而來[12]。游離氨基酸不僅是食品中重要的營養(yǎng)物質(zhì)，也是重要的滋味成分和氣味前體物質(zhì)，同時還能與食品體系中的其他成分協(xié)同，影響其整體風(fēng)味。美拉德反應(yīng)后，氨基酸有所減少，是因為這部分氨基酸轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌L(fēng)味物質(zhì)，成為重要的呈味物質(zhì)[13-14]。

2.3 美拉德反應(yīng)對酶解液肽分子量分布的影響

蛋白酶解液中存在著不同的分子量肽段，不僅發(fā)生熱降解產(chǎn)生美拉德反應(yīng)的中間產(chǎn)物，而且直接參與美拉德反應(yīng)[15]。美拉德反應(yīng)對肽分子量分布的影響見表3。

表3 美拉德反應(yīng)對肽分子量分布的影響Table 3 Changes in peptides before and after Maillard reaction mg/L

由表3可知，EsH-M中分子量大于189 Da的2個組分含量均發(fā)生顯著下降，同時伴隨著小于189 Da的組分含量明顯增加。據(jù)此推測，在此條件下南極磷蝦酶解液-木糖美拉德反應(yīng)體系中肽段的熱降解作用遠大于交聯(lián)作用。鄭曉杰等[16]亦研究發(fā)現(xiàn)雞骨酶解液在弱酸條件下和木糖發(fā)生反應(yīng)后，美拉德體系中分子量小于500 Da的組分含量顯著增加，大于500 Da的組分含量均發(fā)生顯著下降。趙謀明、劉平等[17-18]也報道了不同分子量肽段在美拉德反應(yīng)過程中存在著熱降解情況。南極磷蝦酶解液各肽段與木糖發(fā)生美拉德反應(yīng)的能力不同，其中451 Da～1 450 Da組分具有較高的美拉德反應(yīng)活性，推測該肽段可能含有較高反應(yīng)活性的末端氨基酸。

2.4 美拉德反應(yīng)對酶解液中無機離子含量的影響

水產(chǎn)品中的咸味主要由Na+、K+、Mg2+等無機鹽產(chǎn)生，另外還包括氯化鈉、氯化鉀及鈉、鉀的磷酸鹽[19]。無機鹽的呈味作用不僅在于呈現(xiàn)出咸味，更重要的是某些離子成分會促進水產(chǎn)品中的有機成分的風(fēng)味特性得以發(fā)揮[12]。據(jù)文獻報道[20]，Na+、K+是雪蟹、扇貝和短頸文蛤中共同的呈味活性物質(zhì)。缺少Na+會使雪蟹、扇貝和短頸文蛤提取物中的甜味、咸味顯著下降；缺少K+會使雪蟹、扇貝和短頸文蛤提取物味道變淡，僅保留一點鮮味和特征風(fēng)味。

美拉德反應(yīng)對無機離子含量的影響見表4。

表4 美拉德反應(yīng)對無機離子含量的影響Table 4 The content of inorganic ions in system before and after Maillard reaction mg/L

由表4可知，反應(yīng)前后體系中的無機離子，均以Na+的含量為最高，對美拉德反應(yīng)前后體系的呈味有極重要的貢獻。經(jīng)過美拉德反應(yīng)，Na+、K+、Mg2+含量分別增加了0.53%、4.21%、3.70%，但離子總含量無明顯變化。

2.5 美拉德反應(yīng)對酶解液中脂肪酸組成的影響

美拉德反應(yīng)對脂肪酸組成的影響見表5。

表5 美拉德反應(yīng)對脂肪酸組成的影響Table 5 Fatty acid compositions of total lipids before and after Maillard reaction

由表5可知，采用氣相色譜-質(zhì)譜法分別從EsH和EsH-M中鑒定出11種和4種脂肪酸。EsH脂肪酸總量為27.02 mg/100 g，其中含有飽和脂肪酸17.03 mg/100 g，且以 C16：0和 C10：0為主；還富含多不飽和脂肪酸C22：6n3和 C20：5n3共 5.67 mg/100 g，其中 C20：5n3含量較高。經(jīng)過美拉德反應(yīng)后，EsH-M中脂肪酸含量為2.20 mg/100 g，減少了91.86%的脂肪酸，減少組分以多不飽和脂肪酸為主，此外，還伴有飽和脂肪酸C13：0的增加。曹榮等[21]研究發(fā)現(xiàn)南極磷蝦中飽和脂肪酸含量占總量的32.31%，且以 C16：0和 C14：0為主，多不飽和脂肪酸占38.78%，以 C22：6n-3和 C20：5n-3為主，說明將南極磷蝦酶解并沒有破壞脂肪酸的組成。而美拉德反應(yīng)由于酶解液在高溫下和木糖反應(yīng)，導(dǎo)致不飽和脂肪酸呈現(xiàn)遞減趨勢，直至消失，此結(jié)果與肖作兵等[22]的研究結(jié)果一致，不飽和脂肪酸含量會隨著溫度的升高而呈現(xiàn)遞減趨勢，特別是多不飽和脂肪酸，含量隨溫度變化差異顯著。

3 結(jié)論

美拉德反應(yīng)后，南極磷蝦中酶解液中多數(shù)游離氨基酸含量顯著降低，其中亮氨酸、精氨酸、組氨酸、異亮氨酸、半胱氨酸損失率較大，說明這些氨基酸可能是參與美拉德反應(yīng)以及對反應(yīng)產(chǎn)物風(fēng)味起主要作用的氨基酸；酶解液肽段中451 Da～1 450 Da組分具有較高的美拉德反應(yīng)活性；無機離子含量以Na+含量最高；脂肪酸組成呈現(xiàn)減少趨勢，減少組分以多不飽和脂肪酸為主。