聶文，屠澤慧，郭肖穎，蔡克周，*

（1.合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，安徽合肥230009；2.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程研究所，安徽合肥230001）

丙烯酰胺（Acrylamide，AA）是一種無色無味的結(jié)晶固體，可溶于水、丙酮和乙醇中，20世紀(jì)50年代以來，它被廣泛應(yīng)用于聚丙烯酰胺的工業(yè)化生產(chǎn)和實(shí)驗(yàn)室的電泳和分析研究[1]。AA對(duì)動(dòng)物具有公認(rèn)的神經(jīng)毒性和生殖毒性[2]，還可誘發(fā)小鼠、大鼠和斑馬魚等多種動(dòng)物腫瘤[3-4]，也是一種可能的人類致癌物（2A類）[5]。2002年，瑞典科學(xué)家最先發(fā)現(xiàn)富含碳水化合物的食品在高于120℃的加工（如烹飪，油炸或烘烤）過程中，能生成μg/kg級(jí)的AA[6]，這些AA主要是由食物中游離的天冬酰胺和還原糖在高溫條件通過美拉德反應(yīng)形成[7-9]，同年，WHO對(duì)全球2000多個(gè)食品抽檢顯示，許多高溫加工食品中AA含量高達(dá)飲用水限定標(biāo)準(zhǔn)的500倍，基于此，瑞典國家食品管理局向全世界發(fā)出食用高溫油炸和烘烤食品可能會(huì)導(dǎo)致的AA暴露健康風(fēng)險(xiǎn)的警告[10]。2018年3月28日，美國加利福尼亞州洛杉磯高等法院裁定，在加利福尼亞州出售咖啡的企業(yè)必須在咖啡產(chǎn)品包裝上，須標(biāo)注““致癌警示””信息，原因是咖啡豆在烘焙過程中產(chǎn)生可能致癌的AA。這一新聞再次激起人們對(duì)食品內(nèi)源化學(xué)危害物的關(guān)注。

苯并芘（Benzo（a）pyrene，BaP）是另外一個(gè)普遍關(guān)注的化學(xué)性危害物，BaP是由一個(gè)苯環(huán)和一個(gè)芘分子稠合而成的多環(huán)芳烴類化合物，是最早發(fā)現(xiàn)的環(huán)境致癌物。BaP最初是在化石燃料和木材等有機(jī)物燃燒煙霧中發(fā)現(xiàn)，后發(fā)現(xiàn)廣泛分布在自然環(huán)境中。上世紀(jì)80年代在熏魚中檢出BaP后，陸續(xù)在多種食品中經(jīng)檢測(cè)出，尤其是在熏魚、烤腸、炸雞、植物油、谷物和經(jīng)過高溫?zé)峒庸ぬ幚淼氖称穂11-13]。人類可通過皮膚、呼吸、飲水和食物等多種途徑接觸到BaP，其中通過食品途徑攝入BaP占90%以上[14]。世界各國均對(duì)食品中BaP的殘留量進(jìn)行了嚴(yán)格限制。我國對(duì)食品中BaP的限量標(biāo)準(zhǔn)為肉制品、熏烤動(dòng)物性食品及糧食小于5.0 μg/kg、植物油小于10 μg/kg[15]。歐盟對(duì)BaP的最大限量為熏烤肉制品 5.0 μg/kg、食用油 2.0 μg/kg、谷類及嬰幼兒食品 1.0 μg/kg[16]。

由于食品攝入造成AA和BaP對(duì)人的廣泛暴露，科學(xué)家們圍繞AA和BaP的快速檢測(cè)、形成機(jī)制和控制措施方面開展了大量工作，此外，以離體細(xì)胞、嚙齒動(dòng)物和其他生物模型為對(duì)象，在AA和BaP致毒特點(diǎn)和機(jī)理方面做了大量研究，但現(xiàn)有研究都是獨(dú)立以AA或BaP暴露染毒為研究對(duì)象，綜合考慮AA和BaP通過食物攝入造成共同暴露的普遍性，研究AA和BaP共同暴露染毒的協(xié)同作用至今尚未見報(bào)道。本文以經(jīng)典模式生物秀麗隱桿線蟲為模型，線蟲是一種開展化學(xué)污染物生物學(xué)毒性評(píng)價(jià)的好材料，選取簡單、直接、易測(cè)的生物學(xué)終點(diǎn)是利用好模式生物的重要前提，線蟲生殖腺具有良好的發(fā)育延展性，細(xì)胞凋亡具有穩(wěn)定的規(guī)律，受到環(huán)境應(yīng)激或毒物損失，會(huì)誘發(fā)細(xì)胞凋亡增加，性腺細(xì)胞凋亡終點(diǎn)已被應(yīng)用于重金屬、農(nóng)殘、化學(xué)藥物和活性提取物的毒理和活性評(píng)價(jià)[17]。本試驗(yàn)選擇秀麗隱桿線蟲性腺細(xì)胞凋亡和后代數(shù)量為生物學(xué)終點(diǎn)，研究AA和BaP誘導(dǎo)生殖腺細(xì)胞凋亡的劑量和時(shí)間效應(yīng)，考察AA和BaP的協(xié)同致毒性，為AA合理評(píng)估提供更多理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與線蟲

AA（超純級(jí)，≥99.9%）：阿拉丁試劑公司，用雙蒸水配制成2.0 g/L溶液過濾滅菌后分裝在1.5 mL離心管；BaP（色譜級(jí)，≥99.9%）：sigma試劑公司，用無水乙醇配制成0.01 g/L溶液過濾滅菌后分裝在1.5 mL離心管，每次使用前取樣稀釋。

野生型秀麗隱桿線蟲N2、線蟲食物大腸桿菌OP50：國際線蟲中心（Caenorhabditis Genetics Center，CGC）提供，在實(shí)驗(yàn)室里，線蟲正常在（20±1）℃溫度范圍內(nèi)培養(yǎng)。

1.2 線蟲的同步化處理

用線蟲基礎(chǔ)培養(yǎng)液（2.922 g NaCl，2.236 g KCl，溶于1 000 mL雙蒸水，高壓滅菌）將懷卵成蟲從線蟲生長培養(yǎng)基（nematode growth media，NGM）平板洗下，加入到1.5 mL離心管中，使總體積達(dá)到0.7 mL，然后加入0.3 mL裂解液（5 mol/L NaOH∶5%NaClO=1∶2，體積比，現(xiàn)配現(xiàn)用），間歇彈擊混勻，裂解結(jié)束后立即在1 400 g離心力下離心，移上清，再用線蟲基礎(chǔ)培養(yǎng)液清洗2次，最后將蟲卵于線蟲基礎(chǔ)培養(yǎng)液中過夜孵化，由于沒有添加食物，線蟲全部滯留在L1期[18]。

1.3 生殖腺細(xì)胞凋亡數(shù)的測(cè)定

細(xì)胞凋亡的測(cè)定依Wang所采用方法進(jìn)行修改[17]，將處理后的線蟲置于24孔板內(nèi)，加入500 μL含少量OP50的線蟲基礎(chǔ)培養(yǎng)液，以25 μg/mL的吖啶橙染色1 h，將蟲吸出于Ф35 mm NGM板上恢復(fù)45 min，挑取20條線蟲于30 μL NaN3的載玻片中央，熒光顯微鏡觀察，凋亡的細(xì)胞呈亮黃色或橙黃色，這是DNA片斷化的一個(gè)重要標(biāo)志，而未凋亡的細(xì)胞呈現(xiàn)均勻的淺綠色，改進(jìn)后的方法染色更加清楚。

1.4 線蟲后代數(shù)目測(cè)定

線蟲后代數(shù)量目的測(cè)定參考前人方法[17]，將15只同步化早期成蟲分別單個(gè)移入24孔板內(nèi)，加入500 μL不同濃度AA和BaP含少量OP50的線蟲基礎(chǔ)培養(yǎng)液，1天后將成蟲移入新孔板內(nèi)，以保證不被后代線蟲所混淆，直到線蟲停止產(chǎn)卵，線蟲在24孔板內(nèi)所產(chǎn)蟲卵經(jīng)培養(yǎng)1天后對(duì)孵化線蟲進(jìn)行計(jì)數(shù)，即為后代數(shù)量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用OriginPro 7.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，顯著性檢驗(yàn)采用Student’s t-tests方法，p＜0.05表示差異顯著。所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤的形式表示，利用雙尾t檢驗(yàn)檢測(cè)不同品系線蟲重金屬暴露所導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡的差異，顯著性水平為p＜0.05。

2 結(jié)果分析

2.1 AA暴露誘導(dǎo)線蟲生殖細(xì)胞凋亡

不同濃度AA暴露線蟲12小時(shí)后性腺細(xì)胞凋亡的情況如圖1所示。

圖1 不同AA濃度對(duì)線蟲生殖腺細(xì)胞凋亡的影響Fig.1 Effect on the gonad cells apoptosis of C.elegans with different concentration of AA

如圖1所示，隨著AA濃度的增加，線蟲性腺細(xì)胞凋亡呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，當(dāng)AA濃度在0.5 mg/L濃度范圍以內(nèi)時(shí)，細(xì)胞凋亡增加不明顯，當(dāng)暴露濃度達(dá)到2.0 mg/L和10.0 mg/L時(shí)，線蟲性腺細(xì)胞凋亡數(shù)目由對(duì)照組1.88±0.11分別增加到 3.35±0.21 和 4.1±0.25，差異均顯著（p＜0.05）。進(jìn)一步研究較低AA劑量暴露對(duì)線蟲性腺細(xì)胞凋亡作用的時(shí)間效應(yīng)，線蟲于0.2 mg/L AA濃度下暴露不同時(shí)間效應(yīng)如圖2所示。

如圖2所示，無論線蟲是否有AA暴露處理，其性腺細(xì)胞凋亡均隨時(shí)間延長而增加，24小時(shí)后各組線蟲性腺細(xì)胞凋亡數(shù)均較0 h組顯著增加（p＜0.05），但是整個(gè)暴露時(shí)間內(nèi)（36 h），相比對(duì)照組，AA暴露并不能誘發(fā)性腺細(xì)胞凋亡數(shù)顯著增加（p＞0.05）。

圖2 低濃度AA暴露誘發(fā)線蟲性腺細(xì)胞凋亡的時(shí)間效應(yīng)Fig.1 Effect on the gonad cells apoptosis of C.elegans induced by AA with exposure time

2.2 BaP暴露誘導(dǎo)線蟲生殖細(xì)胞凋亡

不同濃度BaP暴露線蟲12小時(shí)后性腺細(xì)胞凋亡的情況如圖3所示。

如圖3所示，在考察的BaP濃度（0～0.005 mg/L）范圍內(nèi)，線蟲性腺細(xì)胞凋亡呈現(xiàn)先增加后降低的情況，0.000 5 mg/L濃度范圍內(nèi)BaP沒有誘發(fā)性腺細(xì)胞凋亡顯著增加，0.001 mg/L BaP處理組線蟲性腺細(xì)胞凋亡數(shù)由對(duì)照組1.85±0.11增加到3.2±0.18，差異顯著（p＜0.05），而在0.005 mg/L劑量條件下，性腺細(xì)胞凋亡水平反而下降，這可能是過高的濃度可能導(dǎo)致性腺發(fā)育的阻滯。0.000 2 mg/L濃度BaP暴露對(duì)線蟲性腺細(xì)胞凋亡的時(shí)間效應(yīng)如圖4所示。

圖3 不同BaP濃度對(duì)線蟲性腺細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect on the gonad cells apoptosis of C.elegans with different concentration of BaP

圖4 低濃度BaP暴露誘發(fā)線蟲性腺細(xì)胞凋亡的時(shí)間效應(yīng)Fig.4 Effect on the gonad cells apoptosis of C.elegans induced by BaP with exposure time

如圖4所示，線蟲性腺細(xì)胞凋亡均隨時(shí)間延長而增加，24 h和36 h檢測(cè)點(diǎn)相比0 h檢測(cè)點(diǎn)，線蟲性腺細(xì)胞凋亡數(shù)均顯著增加（p＜0.05），但是整個(gè)暴露時(shí)間內(nèi)（36 h），0.000 2 mg/L濃度BaP暴露處理并不能誘發(fā)性腺細(xì)胞凋亡數(shù)顯著增加（p＞0.05）。

2.3 AA和BaP暴露協(xié)同誘導(dǎo)線蟲生殖細(xì)胞損傷

為了研究AA和BaP暴露對(duì)性腺細(xì)胞的協(xié)同損傷作用，將線蟲暴露于含有0.2 mg/L AA和0.000 2 mg/L BaP環(huán)境中，結(jié)果如圖5所示。

圖5 AA和BaP暴露協(xié)同誘導(dǎo)線蟲性腺細(xì)胞凋亡的時(shí)間效應(yīng)Fig.5 Effect on the gonad cells apoptosis of C.elegans induced by AA and BaP

如圖5所示，與前面研究相同的是處理組和對(duì)照組線蟲性腺細(xì)胞凋亡均隨時(shí)間延伸而呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，相比對(duì)照組，在12小時(shí)后染毒組性腺細(xì)胞凋亡顯著增加（p＜0.05），其后盡管對(duì)照組凋亡細(xì)胞數(shù)也有明顯增加，但是染毒組增加更加明顯，結(jié)果表明AA和BaP暴露對(duì)線蟲性腺具有明顯的協(xié)同作用。進(jìn)一步考察低濃度AA和BaP暴露對(duì)線蟲后代數(shù)量的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖6 AA和BaP暴露誘導(dǎo)線蟲后代數(shù)量降低Fig.6 Effectonthebroodsizeof C.elegans inducedbyAAandBaP

如圖6所示，0.2 mg/L水平AA和0.000 2 mg/L水平BaP均不能誘發(fā)線蟲后代數(shù)量的顯著降低，但共同染毒處理則導(dǎo)致后代數(shù)量由對(duì)照組110±7.2降低到75±6.2，差異顯著（p＜0.05），結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了 AA 和BaP能協(xié)同誘發(fā)線蟲生殖損傷。

3 討論

線蟲生殖腺是AA和BaP暴露毒性良好的生物學(xué)檢測(cè)終點(diǎn)。自1974年Brenner[19]最先提出利用秀麗隱桿線蟲進(jìn)行環(huán)境毒理學(xué)研究的可行性，作為一種活體生物，其3 d～4 d相對(duì)較短的生殖周期和4周左右的壽命，是一種良好的開展活體研究的生物模型，經(jīng)過多年發(fā)展，線蟲已經(jīng)廣泛應(yīng)用于環(huán)境化學(xué)污染物毒理評(píng)價(jià)等方面的研究。早期，主要以線蟲致死或半致死為檢測(cè)終點(diǎn)，評(píng)價(jià)化學(xué)污染物的急性毒性[20]，后來發(fā)展了以線蟲發(fā)育狀況[21]、繁殖性能[22]、壽命[23]和攝食行為[24]等非致死生物學(xué)終點(diǎn)，應(yīng)用于重金屬、農(nóng)殘、化學(xué)藥物和空氣負(fù)離子等環(huán)境因子的生物學(xué)評(píng)價(jià)。但是急性致死試驗(yàn)所暴露劑量通常較高，與實(shí)際環(huán)境中污染物濃度相差甚遠(yuǎn)，而非致死性檢測(cè)點(diǎn)，如壽命和攝食行為等有存在周期相對(duì)較長和難以控制等不利因素。Kazuhiro等將線蟲進(jìn)行BaP急性染毒，檢測(cè)其半致死劑量為0.05 mg/L[25]，而Li檢測(cè)線蟲暴露染毒AA的半致死劑量高達(dá)897 mg/L，誘發(fā)攝食行為發(fā)生明顯變化的劑量為10 mg/L[26]，Wang以線蟲生殖腺為研究體系，研究了重金屬砷對(duì)生殖腺的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)較低濃度砷即可誘導(dǎo)性腺周期阻滯和細(xì)胞凋亡，表明線蟲的生殖腺是研究化學(xué)污染物毒性的良好模型[27]。

線蟲具有一對(duì)U形的生殖腺，兩個(gè)生殖腺臂通過中央的子宮相連。成體線蟲生殖腺的遠(yuǎn)端細(xì)胞是生殖干細(xì)胞，終身具有絲分裂能力，遠(yuǎn)端往后是一段約20個(gè)細(xì)胞直徑的過渡區(qū)，有絲分裂和減數(shù)分裂同時(shí)存在，過渡區(qū)之后是減數(shù)分裂區(qū)，染色體在此區(qū)域形成聯(lián)會(huì)復(fù)合體。在正常生理?xiàng)l件下，為維持生殖細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，約50%的有絲分裂細(xì)胞會(huì)在發(fā)育過程中凋亡，這一過程謂之“生理性細(xì)胞凋亡”，當(dāng)受到環(huán)境危害物脅迫時(shí)，細(xì)胞凋亡數(shù)目顯著增加[28]。在本試驗(yàn)中，我們測(cè)定了AA和BaP暴露下線蟲生殖細(xì)胞凋亡，通過對(duì)不同濃度（0～0.005 mg/L）AA 和（0～10.0 mg/L）BaP 暴露的研究發(fā)現(xiàn)，它們均可誘導(dǎo)線蟲生殖細(xì)胞凋亡增加，并與濃度密切相關(guān)，2.0 mg/L的AA暴露12 h可誘發(fā)線蟲生殖腺細(xì)胞顯著增加，而對(duì)于BaP在相同處理時(shí)間內(nèi)誘發(fā)生殖腺細(xì)胞顯著增加的劑量只要0.001 mg/L，這也表明BaP的生物學(xué)毒性要高AA達(dá)千倍以上。此外，BaP誘發(fā)的生殖細(xì)胞具有多效性，較低濃度（0.000 2 mg/L）BaP暴露誘導(dǎo)生殖細(xì)胞凋亡增加，而較高濃度（0.001 mg/L）暴露對(duì)細(xì)胞凋亡具有抑制作用。產(chǎn)生這種效應(yīng)的原因可能與誘發(fā)生殖腺的發(fā)育阻滯有關(guān)，發(fā)育阻滯導(dǎo)致生殖細(xì)胞總數(shù)的降低，從而表現(xiàn)出凋亡細(xì)胞數(shù)目的下降。相比BaP半致死劑量為0.05 mg/L和AA半致死劑量897 mg/L，線蟲生殖腺細(xì)胞凋亡檢測(cè)點(diǎn)敏感濃度分別降低了50倍和450倍。這也表明線蟲生殖腺是AA和BaP暴露毒性良好的生物學(xué)檢測(cè)終點(diǎn)。

流行病學(xué)研究顯示，由于食品造成AA和BaP的攝入占據(jù)化學(xué)污染物接觸的主要部分，油炸和烘烤食品因其固有風(fēng)味和便捷性特點(diǎn)，是被世界各國廣為喜愛的食品，這些食品也是人們主要的AA攝入源，此外高溫加工過程中，脂肪酸環(huán)化和蛋白質(zhì)的裂解也可以生產(chǎn)不同水平的BaP[15，29]。同樣，煙熏和燒烤類食品的攝入與煙草的消費(fèi)也會(huì)伴隨著化學(xué)危害物BaP的接觸[11，14]。AA和BaP在動(dòng)物和人體內(nèi)或離體的生物學(xué)作用是否存在協(xié)同目前還沒有報(bào)道。在本試驗(yàn)中，我們測(cè)定了0.2 mg/L的AA和0.000 2 mg/L的BaP單獨(dú)暴露時(shí)，在36 h內(nèi)都不能誘發(fā)線蟲生殖腺細(xì)胞凋亡的顯著增加，但是將這一劑量的AA和BaP共同暴露線蟲時(shí)，在暴露12 h時(shí)，就檢測(cè)到生殖腺細(xì)胞凋亡的顯著增加，并隨著暴露時(shí)間的延長，處理組線蟲生殖腺細(xì)胞凋亡較生理性凋亡呈現(xiàn)明顯的增加趨勢(shì)，這表明AA和BaP對(duì)生殖腺的毒理作用存在協(xié)同作用，而后代數(shù)量的顯著下降對(duì)這一協(xié)同作用更進(jìn)一步驗(yàn)證。