程陽，吳思雅，侯玲鳳，蔣慧靜，吳宇峰，吳明江，張旭

（溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江溫州325000）

便秘是消化系統(tǒng)的常見癥狀之一，是一種功能性腸道疾病[1]。便秘的成因常常是糞便長時間駐留在腸道內(nèi)，排便次數(shù)減少，糞便干燥，排出費力[2]，進而引起排便異常，即形成便秘。隨著生活節(jié)奏的加快和膳食結(jié)構(gòu)的變化，便秘的發(fā)病率在逐年上升，逐漸成為當(dāng)今社會常見的臨床癥狀，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量和身體健康。現(xiàn)代研究表明，便秘可導(dǎo)致肛腸疾病、胃腸疾病、結(jié)腸癌、心臟病，并可影響大腦功能[3]。目前使用瀉藥是臨床上用于治療便秘的主要方法，該法通過刺激患者腸道分泌并減少腸道內(nèi)吸收的方法達到治療便秘的目的。但長期使用瀉藥所產(chǎn)生的毒副作用會對人體產(chǎn)生威脅，如引起腸粘膜吸收障礙，嚴(yán)重時會出現(xiàn)體內(nèi)脫水，電解質(zhì)紊亂，甚至出現(xiàn)頑固性便秘[4]。因此，便秘越來越受到人們的重視。尋找一種毒副作用小且能緩解便秘的天然產(chǎn)物，已逐漸成為醫(yī)學(xué)研究的熱點方向。

羊棲菜[Sargassum fusiforme（Harv.）Seteh.]隸屬褐藻門，圓子綱，墨角藻目，馬尾藻科，馬尾藻屬，是藥食兩用的大型海藻，素有“長壽菜”之美譽[5-6]。羊棲菜生長于沿海地區(qū)，在中國、日本和韓國的沿海地區(qū)均有分布。目前，羊棲菜已在我國南方的海區(qū)大量人工養(yǎng)殖，是一種重要的出口創(chuàng)匯海藻資源。在《神農(nóng)本草經(jīng)》[7]上即有關(guān)于羊棲菜的食療性質(zhì)和給藥方法的記載。羊棲菜性味苦、咸、寒，具利水消腫，瀉熱化痰，消食化瘀功能。羊棲菜多糖（S.fusiforme polysaccharides，SFPS）是羊棲菜的主要活性成分，包括褐藻酸（約占干重的28.4%）、巖藻聚糖硫酸酯（約占干重的8.1%）和褐藻淀粉（約占干重的0.5%）[8]。羊棲菜多糖具有抗腫瘤、抗氧化、降血糖、降血脂和免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性[9-10]，近年來對羊棲菜多糖中巖藻聚糖硫酸酯的活性研究較為廣泛，而對含量更高的褐藻酸研究相對較少。褐藻酸廣泛存在于海帶、馬尾藻等褐藻植物細胞壁中，由英國人Stanford在1881年首次從中分離得到。它不溶于氯仿、丙酮、乙醇等有機溶劑，是一種水溶性酸性多糖物質(zhì)。褐藻酸由1，4-β-D-甘露糖醛酸（M）和1，4-α-L-古羅糖醛酸（G）兩種糖醛酸單體聚合而成。褐藻酸主要以游離酸、一價鹽（鈉鹽、鉀鹽）和二價鹽（鈣鹽等）的形式存在于自然環(huán)境中，商品褐藻酸主要以鈉鹽為主[11]。有研究表明，褐藻酸鈉具有抗病毒、提高免疫力、清除自由基、促進益生菌增殖、促進生長等作用[12-14]。研究表明許多天然多糖類化合物具有改善動物體內(nèi)腸道微生態(tài)的作用，可起到益生元的效果，是理想的通便功能劑和微生態(tài)調(diào)節(jié)劑[15-18]。然而，羊棲菜褐藻酸鈉是否具有潤腸通便功效，仍未見文獻報道。本試驗研究羊棲菜褐藻酸鈉對便秘模型小鼠的潤腸通便作用，對揭示羊棲菜褐藻酸鈉調(diào)節(jié)腸胃功能的機理具有重要的理論意義，同時為羊棲菜功能食品的開發(fā)提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊棲菜自浙江省溫州市洞頭區(qū)羊棲菜養(yǎng)殖基地，采集時間為2017年10月初，經(jīng)溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院植物分類教研室鑒定為褐藻門馬尾藻科馬尾藻屬植物羊棲菜；健康雄性ICR小鼠，8周齡，體質(zhì)量為18 g～22 g，購于溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物使用許可證號SYXK（浙）2015-0009。

復(fù)方地芬諾酯（有效成份為地芬諾酯，每片含有效成份量為2.5 mg）：長春長紅制藥有限公司；阿拉伯樹膠、活性炭（粉狀）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S）：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；紅外光譜儀（Tensor 27）：BRUKER公司。

1.3 方法

1.3.1 羊棲菜褐藻酸鈉的制備

羊棲菜經(jīng)烘干粉碎后脫脂，得脫脂藻粉。脫脂藻粉85℃熱水提取3次，每次3 h。過濾后，取濾渣在80℃下用2%的碳酸鈉提取3次，每次3h，每1kg樣品中加入30 L的水，合并濾液并過濾，得到褐藻酸提取液。用1 mol/L鹽酸調(diào)pH值至6～7，加入等體積100g/L的氯化鈣溶液，輕輕攪拌使其充分絮凝，靜置1 h，8 000 r/min離心得到褐藻酸鈣。向褐藻酸鈣中加入1 mol/L鹽酸，不斷攪拌，調(diào)節(jié)pH值至2，酸化2 h后，加入40 g/L的氫氧化鈉溶液，至溶液pH值為8。溶液經(jīng)800 r/min離心后，冷凍干燥，得到褐藻酸鈉樣品[19]，提取率約為20%。

1.3.2 糖醛酸、蛋白質(zhì)含量測定

利用間羥基聯(lián)苯法測定糖醛酸含量[20]；利用考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量[21]。

1.3.3 紅外光譜分析

取少量干燥樣品，加入適量溴化鉀粉末，并在紅外干燥箱中充分研磨，壓片，在500 cm-1～4 000 cm-1范圍內(nèi)進行紅外掃描。

1.3.4 動物分組及給藥

試驗方案參照《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》[22]。雄性ICR小鼠60只，飼養(yǎng)條件為濕度（60±5）%，溫度（25±1）℃，12 h的光照以及12 h黑暗，自由攝食飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，將小鼠隨機分為6組，即空白組、模型組和4個褐藻酸鈉劑量組 [分別為30、100、300、1 000 mg/（kg·d）]，空白組和模型組均灌胃蒸餾水。每天1次，連續(xù)7 d，在試驗前后稱量每只小鼠的體重。

1.3.5 小鼠排便試驗

根據(jù)《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》制備墨汁以及復(fù)方地芬諾酯混懸液。

墨汁的制備：準(zhǔn)確稱取阿拉伯樹膠100 g，加入800 mL水，混合并煮沸至溶液澄清后加入50 g活性碳粉，煮沸3次，待溶液冷卻后加水定容至1 000 mL，4℃保存。復(fù)方地芬諾酯混懸液（用于建立小鼠小腸蠕動抑制模型）的制備：分別取復(fù)方地芬諾酯粉末25 mg和50 mg，加入蒸餾水100 mL配制成質(zhì)量濃度為250 μg/mL和500 μg/mL的復(fù)方地芬諾酯混懸液，灌胃劑量分別為5 mg/kg和10 mg/kg。

末次給藥后，小鼠禁食不禁水16 h，除空白組小鼠灌胃同體積的蒸餾水外，其余各組分別灌胃500 μg/mL的復(fù)方地芬諾酯混懸液10 mg/kg。30分鐘后，劑量組灌胃含相應(yīng)褐藻酸鈉的墨汁，空白組和模型組灌胃墨汁，同時開始計時。每只小鼠單獨飼養(yǎng)，自由飲水、攝食，觀察記錄每只小鼠首次排黑便的時間、5 h排黑便粒數(shù)，并及時稱量排出糞便的質(zhì)量。

1.3.6 小腸運動試驗

再選取雄性ICR小鼠60只，動物飼養(yǎng)分組同1.3.5節(jié)。末次給藥后，各組小鼠禁食不禁水16 h，除空白組小鼠灌胃同體積的蒸餾水外，其余各組分別灌胃250 μg/mL的復(fù)方地芬諾酯混懸液5 mg/kg。30分鐘后，劑量組灌胃含相應(yīng)褐藻酸鈉的墨汁，空白組和模型組灌胃墨汁，同時開始計時。灌胃墨汁25分鐘后，頸椎脫臼處死小鼠，打開腹腔分離腸系膜，剪取上端自幽門、下端至回盲部的腸管，置于托盤上，輕輕將小腸拉成直線進行測量，得到“小腸總長度”，從幽門至墨汁前沿為“墨汁推進長度”，按下列公式計算墨汁推進率。

式中：L0為墨汁推進長度，cm；L為小腸總長度，cm。

1.4 統(tǒng)計分析及結(jié)果判定

采用Graphpad prism 5軟件進行統(tǒng)計分析。在便秘模型成立的條件（P＜0.01）下，小鼠的首次排黑便所需時間、5小時內(nèi)排便粒數(shù)、糞便質(zhì)量和墨汁推進率的顯著性分析均采用單因素方差多重比較（One-Way ANOVA），P＜0.05表示有顯著性差異，P＜0.01表示有極顯著差異，實驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。參照《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》，上述5小時內(nèi)排糞便重量和排黑便粒數(shù)任一項結(jié)果陽性，同時小腸運動實驗和首粒排便時間任一項結(jié)果陽性，可判定羊棲菜褐藻酸鈉對便秘模型小鼠的潤腸通便作用的試驗結(jié)果顯陽性[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊棲菜褐藻酸鈉的理化性質(zhì)分析

羊棲菜褐藻酸鈉為棕黃色粉末，易溶于水，糖醛酸含量為76.34%，蛋白質(zhì)含量為0.6%。

羊棲菜褐藻酸鈉的紅外光譜見圖1。3 426 cm-1處的峰為羥基O-H的伸縮振動，2 930 cm-1處的吸收峰為糖類C-H伸縮振動，1 615 cm-1和1 419 cm-1處的吸收峰分別為-COO-中C=O的非對稱伸縮振動和對稱伸縮振動，1 306 cm-1處的吸收峰為-COOH中O-H的變角振動，1 092 cm-1和1 036 cm-1處的吸收峰分別為吡喃糖環(huán)的醚鍵（C-O-C）和羥基（C-O-H）的伸縮振動，940 cm-1處的吸收峰為吡喃糖環(huán)的非對稱環(huán)伸縮振動，872 cm-1處的吸收峰為C2和C4位上平伏鍵構(gòu)型的C-H的變角振動，817 cm-1處為甘露糖醛酸的特征吸收峰。

圖1 羊棲菜褐藻酸鈉的紅外光譜圖Fig.1 Infra-red spectra of Sargassum fusiforme sodium alginate

2.2 羊棲菜褐藻酸鈉對小鼠體質(zhì)量的影響

羊棲菜褐藻酸鈉對小鼠體質(zhì)量的影響見圖2。

圖2 排便試驗和小腸運動試驗前后小鼠體質(zhì)量的比較Fig.2 Effect on body weights by Sargassum fusiforme sodium alginate treatment in defecation experiment and intestinal movement experiment on day 0 and day 7

由圖2可知，在排便試驗和小腸運動試驗中，各組小鼠的初始體質(zhì)量分別與空白組比較，均無顯著性差異（P＞0.05），說明試驗中小鼠分組是均衡的。經(jīng)灌胃處理7天后，各組的小鼠體質(zhì)量與空白組比較，無顯著性差異（P＞0.05），說明羊棲菜褐藻酸鈉處理對小鼠體質(zhì)量沒有不良影響。

2.3 羊棲菜褐藻酸鈉對小鼠排便的影響

羊棲菜褐藻酸鈉對模型小鼠首粒排便時間、排便粒數(shù)和糞便質(zhì)量的影響見圖3。

由圖3可知，小鼠排便試驗中，與空白組比較，模型組的首粒排黑便的時間、5小時內(nèi)排黑便粒數(shù)和糞便質(zhì)量均有極顯著性的差異（P＜0.01），表明小鼠便秘模型建立成功。與模型組相比，羊棲菜褐藻酸鈉的300 mg/（kg·d）和1 000 mg/（kg·d）組小鼠的糞便粒數(shù)、糞便質(zhì)量以及首粒排便時間有極顯著性的差異（P＜0.01），而且隨劑量的增加，羊棲菜褐藻酸鈉促排便效應(yīng)增加，呈現(xiàn)劑量依賴性。

圖3 羊棲菜褐藻酸鈉對模型小鼠首粒排便時間、排便粒數(shù)和糞便質(zhì)量的影響Fig.3 Effect of Sargassum fusiforme sodium alginate on the time for first black excrement，faece number and faece weight

2.4 羊棲菜褐藻酸鈉對小鼠小腸蠕動的影響

羊棲菜褐藻酸鈉對小鼠小腸墨汁推進率的影響見表1。

表1 羊棲菜褐藻酸鈉對小鼠小腸墨汁推進率（±s）的影響Table 1 Effect of Sargassum fusiforme sodium alginate on intestinal ink propelling（±s）

表1 羊棲菜褐藻酸鈉對小鼠小腸墨汁推進率（±s）的影響Table 1 Effect of Sargassum fusiforme sodium alginate on intestinal ink propelling（±s）

注：^^表示與空白組相比，差異極顯著（P＜0.01）；*表示與模型組比較，差異顯著（P＜0.05）；**表示與模型組比較，差異極顯著（P＜0.01）。

組別小鼠排便實驗指標(biāo)小腸總長度/cm墨汁推進長度/cm 推進率/%空白組 45.72±2.324 28.18±2.829 61.71±6.134模型組 48.11±4.179 19.22±3.579 40.20±7.625^^褐藻酸鈉30 mg/（kg·d）45.45±3.616 22.44±5.338 49.97±14.005褐藻酸鈉100 mg/（kg·d）44.10±5.440 22.24±2.822 51.20±9.331*褐藻酸鈉300 mg/（kg·d）45.07±3.033 24.61±3.555 54.30±5.437**褐藻酸鈉1 000 mg/（kg·d）47.17±1.275 27.46±3.824 58.40±7.454**

由表1可知，模型組的墨汁推進率與空白組差異極顯著（P＜0.01），說明便秘模型成立。羊棲菜褐藻酸鈉給藥組小鼠的墨汁推進率均高于模型組，且呈劑量依賴性。與便秘模型組比較，羊棲菜褐藻酸鈉100 mg/（kg·d）劑量組能明顯提高墨汁推進率（P＜0.05），300 mg/（kg·d）和1 000 mg/（kg·d）劑量組可以極顯著（P＜0.01）提高墨汁推進率，表明羊棲菜褐藻酸鈉具有促進小鼠小腸蠕動的作用。

3 結(jié)論與討論

良好的吸水性和保水性是褐藻酸鈉的特性。孫春祿將褐藻酸鈉和鈣鹽混合后制成凝膠并加入肉制品中，以觀察其對肉制品持水力的影響，發(fā)現(xiàn)相同工藝條件下不同凝膠強度的褐藻酸鈉對肉制品持水力的影響不同[23]。褐藻酸鈉因其具有良好的凝膠特性，常常作為一種乳化劑應(yīng)用于冰淇淋和雪糕中，可提高冰淇淋和雪糕的體積和膨脹率，口感更好。因此，我們推測羊棲菜褐藻酸鈉的通便功能可能與下列因素有關(guān)：褐藻酸鈉可能在消化道中吸水膨脹，同消化道中其他“廢物”形成柔軟的糞便，刺激和促進腸蠕動，使之易于排出，同時縮短代謝產(chǎn)物及有害物質(zhì)在大腸的停留時間，減少這些物質(zhì)對腸道的刺激時間和重吸收時間。

褐藻酸鈉可以顯著促進小鼠小腸推進作用，明顯縮短排首粒黑便時間，同時增加其5 h排黑便粒數(shù)和質(zhì)量，展現(xiàn)出良好的潤腸通便功效。在整個試驗過程中，羊棲菜褐藻酸鈉沒有對小鼠的體質(zhì)量造成影響，也沒有觀察到小鼠有腹瀉等不良癥狀，表明其潤腸通便作用的溫和性。本研究為羊棲菜褐藻酸鈉在潤腸通便、防治便秘等保健食品領(lǐng)域的深度開發(fā)提供了理論支持。