劉樂，丁一，王淑軍，2，房耀維，呂明生，*

（1.淮海工學(xué)院海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院，江蘇連云港222005；2.江蘇省海洋資源開發(fā)研究院（連云港），江蘇連云港222005）

右旋糖酐（又稱葡聚糖）是以α-1，6糖苷鍵連接為主，側(cè)鏈含有 α-1，2、α-1，3、α-1，4 糖苷鍵的大分子多聚糖[1]。隨著分子量增加，右旋糖酐黏性不斷增大[2]。研究表明，制糖過程中絕大部分的糖損失是由微生物污染造成。甘蔗收獲后堆放在糖廠，在溫暖潮濕的環(huán)境下存放14小時后，由于微生物的作用可產(chǎn)生右旋糖酐，其中腸系膜明串珠菌（Leuconostocmesenteroides）和乳酸菌（Lactobacillus）是主要的菌群[3-5]。右旋糖酐的產(chǎn)生會導(dǎo)致蔗汁黏度增大、影響沉降速度和清潔效率、旋光度虛假升高等不良后果，對制糖工業(yè)造成經(jīng)濟(jì)損失[6]。雖然通過物理方法，如超濾、膜透析和反滲透可以清除右旋糖酐，但經(jīng)濟(jì)成本相對較高[7]。目前，在制糖業(yè)中通用的方法是酶解法[8-9]。

右旋糖酐酶可將右旋糖酐水解成低分子量的糖，從而清除甘蔗汁中的右旋糖酐。目前制糖業(yè)中所使用的右旋糖酐酶主要來源于霉菌細(xì)麗毛殼菌（Chaetomium gracile）和毛殼菌（Chaetomium erraticum）[10]。霉菌的生產(chǎn)周期較長，酶制備技術(shù)存在一定的安全隱患，仍需完善[11-12]。超聲波是一種高強(qiáng)度的聲波能量，在處理加工具有生物功能的大分子上應(yīng)用廣泛[13]。已有文獻(xiàn)報道，超聲能夠提高酶的催化活性[14]。研究表明，超聲波的氣穴效應(yīng)會增強(qiáng)酶在底物分子表面運(yùn)轉(zhuǎn)，空氣的機(jī)械沖擊會使底物與酶更易復(fù)合[15]。本研究使用本實驗室保存的海洋氧化節(jié)桿菌（Arthrobacter oxydans）KQ11右旋糖酐酶對其清除甘蔗汁中右旋糖酐的條件進(jìn)行了優(yōu)化，為其在制糖生產(chǎn)中的應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甘蔗：購于當(dāng)?shù)爻校瑢⒏收嵴ブ?，?jīng)離心機(jī)以20 000 g離心20 min，取上清即為甘蔗汁樣品；酵母粉：英國Oxiod公司；右旋糖酐20000、魚粉蛋白胨、氯化鈉、硫酸鎂、3，5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀、苯酚、無水亞硫酸鈉、乙酸：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（均為分析純）；三氯乙酸、無水乙醇、氫氧化鈉、鹽酸：南京化學(xué)試劑有限公司（均為分析純）；麥芽糖（生物試劑）：滬式試劑有限公司。右旋糖酐酶：KQ11在25℃，200 r/min，發(fā)酵28h，經(jīng)離心，上清即為粗酶液；KQ11發(fā)酵培養(yǎng)基配方：酵母粉（1.0 g/L）、蛋白胨（5.0 g/L）、MgSO4（0.4g/L）、NaCl（4.0 g/L）、右旋糖酐20 000（10.0 g/L），蒸餾水配置，用NaOH溶液調(diào)整pH值至7.5。

MULTIFUGE X3R高速冷凍離心機(jī)：美國賽默飛公司；梅特勒臺式pH計：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；YP2001電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；AP-01P真空泵：天津奧特賽恩斯儀器有限公司；Bio-Rad全自動酶標(biāo)儀：美國Bio-Rad有限公司；UV9000紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器責(zé)任有限公司；DK-8D型電熱恒溫水槽：上海一恒科技有限公司；NDJ-1型旋轉(zhuǎn)式粘度計：上海天平儀器廠；Brason超聲儀：必能信超聲（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 右旋糖酐含量變化

將榨好的甘蔗汁在室溫下暴露于空氣中，自然發(fā)酵10 d，每天用高速冷凍離心機(jī)將甘蔗汁以20 000 g離心20 min，測定上清右旋糖酐含量。

1.2.2 單因素試驗

1.2.2.1 pH值對右旋糖酐清除的影響

量取400 mL甘蔗汁樣品，平均分裝到8支錐形瓶中，測定右旋糖酐含量，用0.1 mol/L NaOH或HCl將pH 值分別調(diào)節(jié)至 4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，按每毫升甘蔗汁加入0.1U右旋糖酐酶液，45℃水浴保溫10 min，取出后置于沸水中2 min滅活右旋糖酐酶，冷卻至室溫后測定各組樣品右旋糖酐含量，用公式（1）計算右旋糖酐清除率。

1.2.2.2 反應(yīng)溫度對右旋糖酐清除的影響

量取400 mL甘蔗汁樣品，平均分裝到8支錐形瓶中，測定右旋糖酐含量，用0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)甘蔗汁pH值至6.0，按每毫升甘蔗汁加入0.1U右旋糖酐酶液。設(shè)置水浴溫度分別為35、40、45、50、55、60、65、70℃，保溫10 min。之后操作與1.2.2.1同。

1.2.2.3 反應(yīng)時間對右旋糖酐清除的影響

量取400 mL甘蔗汁樣品，平均分裝到8支錐形瓶中，測定右旋糖酐含量，用0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至6.0，按每毫升甘蔗汁加入0.1U的右旋糖酐酶液。置于 45 ℃水浴鍋中分別水浴中保溫 5、10、15、20、25、30、35、40 min。之后操作與 1.2.2.1 同。

1.2.2.4 酶添加量對右旋糖酐清除的影響

量取300 mL甘蔗汁樣品，平均分裝到6支錐形瓶中，測定右旋糖酐含量，用0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至6.0，按每毫升甘蔗汁分別加入0.01、0.02、0.05、0.10、0.15、0.2 U的右旋糖酐酶液，置于45℃水浴中保溫10 min。之后操作與1.2.2.1同。

1.2.3 正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用正交試驗對右旋糖酐酶清除甘蔗汁中右旋糖酐最佳反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，正交試驗表見表1。

表1 L9（34）正交試驗表Table 1L9（34）horizontal orthogonal experiment

1.2.4 超聲對清除右旋糖酐的影響

1.2.4.1 超聲時間

量取甘蔗汁樣品200 mL，測定右旋糖酐含量，用0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至6.5，平均分裝到4支錐形瓶，按每毫升甘蔗汁加入0.1U右旋糖酐酶液，置于超聲波儀中，反應(yīng)溫度50℃，功率300 W，分別超聲1、5、10、15 min，之后操作與 1.2.2.1 同。

1.2.4.2 超聲功率

量取甘蔗汁樣品150 mL，用快速掃描檢測法測定右旋糖酐含量，用0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至6.5，平均分裝到3支錐形瓶，按每毫升甘蔗汁加入0.1U右旋糖酐酶液，置于超聲波儀中，反應(yīng)溫度50℃，超聲功率分別設(shè)置為 200、400、600 W，超聲/間歇時間 3 s/3 s，準(zhǔn)確超聲15 min。待蔗汁溫度降至25℃，測定其黏度，操作同1.2.1。之后操作與1.2.2.1同。

1.2.5 右旋糖酐含量測定

采用快速掃描檢測法[16]。右旋糖酐能夠與無水乙醇作用，在OD720處有最大吸收峰。用右旋糖酐標(biāo)準(zhǔn)溶液測定并繪制右旋糖酐標(biāo)準(zhǔn)曲線。以右旋糖酐含量（C：mg/L）對吸光度（A）進(jìn)行線性回歸，回歸方程為：A=0.001 8C+0.006 7（R2=0.999 6）

1.2.6 右旋糖酐清除率的計算

1.2.7 酶活測定

采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法繪制麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，并測定待測樣品酶活。以麥芽糖的含量（C：mg/mL）對吸光度（A）進(jìn)行線性回歸，回歸方程為：A=0.499 5C+0.064 4（R2=0.999 2）。

1.2.8 黏度測定

將待測甘蔗汁加入到NDJ-1型旋轉(zhuǎn)式黏度計的0號轉(zhuǎn)子中，保持溫度在25℃穩(wěn)定后，啟動黏度計使轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速在60 r/min，觀察黏度計表盤讀數(shù)，將讀數(shù)代入公式 η=κ·α，式中：η 為絕對黏度，mPa·s；κ 為黏度系數(shù)；α為指針?biāo)缸x數(shù)。分別測定最優(yōu)條件處理前與處理后蔗汁的黏度。

2 結(jié)果與分析

2.1 右旋糖酐含量變化

室溫下（25℃）甘蔗汁中右旋糖酐含量的變化見圖1。

如圖1，在室溫下（25℃），微生物會消耗蔗糖生成右旋糖酐，右旋糖酐含量平均每天增加8.67 mg/L，平均每天增長率為4.3%。這會導(dǎo)致制糖企業(yè)在生產(chǎn)過程中糖回收率降低，產(chǎn)品質(zhì)量下降。

2.2 單因素試驗

2.2.1 pH值對右旋糖酐清除的影響

本試驗中，酶劑量0.1 U/mL甘蔗汁，反應(yīng)溫度45℃，反應(yīng)時間10 min。在pH 4.5～6.0，右旋糖酐清除率穩(wěn)定而緩慢增加，當(dāng)pH值高于6.5時，右旋糖酐清除率顯著下降，見圖2。

圖1 室溫下甘蔗汁中右旋糖酐含量的變化Fig.1 Changes of dextran content in sugarcane juice at room temperature

圖2 pH值對右旋糖酐清除率的影響Fig.2 Effect of pH value on the ratio of hydrolysis of dextran

新鮮甘蔗汁的pH值為中性，微生物生長則造成甘蔗汁中右旋糖酐含量增加和pH值降低，制糖企業(yè)中，甘蔗汁進(jìn)行過濾澄清之前，pH值為5.0～6.0[5]。微酸條件不影響氧化節(jié)桿菌KQ11右旋糖酐酶對右旋糖酐的清除作用。

2.2.2 反應(yīng)溫度對清除右旋糖酐的影響

反應(yīng)溫度為35℃～60℃，右旋糖酐清除率相對穩(wěn)定，在45℃時，達(dá)到最高，清除率為81.4%。反應(yīng)溫度高于65℃時，右旋糖酐清除率迅速下降，見圖3。

當(dāng)反應(yīng)溫度高于65℃時，右旋糖酐酶變性失活，然而，甘蔗汁存放以及早期處理過程的溫度為20℃～40℃。氧化節(jié)桿菌KQ11右旋糖酐酶可滿足制糖工藝中甘蔗汁前處理階段的溫度要求。

2.2.3 反應(yīng)時間對清除右旋糖酐的影響

反應(yīng)時間對右旋糖酐清除率的影響見圖4。

如圖4，在5 min～40 min反應(yīng)時間內(nèi)，右旋糖酐清除率保持穩(wěn)定，反應(yīng)5 min，右旋糖酐酶即可有效清除甘蔗汁中的右旋糖酐。淡紫色擬青霉（Paecilomyceslilacinus）右旋糖酐酶在30℃，反應(yīng)24 h，可清除70%的右旋糖酐[15]，而本研究所用的右旋糖酐酶反應(yīng)5 min即可達(dá)到70%的清除率，極大節(jié)約了時間成本。

2.2.4 酶劑量對清除右旋糖酐的影響

酶劑量為0.02 U/mL～0.10 U/mL甘蔗汁時，隨著酶劑量增加，右旋糖酐清除率不斷提高。當(dāng)酶劑量為0.1U/mL甘蔗汁時，右旋糖酐清除率最高，達(dá)到80.15%，見圖5。

最優(yōu)的酶含量可加速酶解反應(yīng)，但是當(dāng)繼續(xù)增加酶的含量時，水解率不會進(jìn)一步提高。甘蔗汁的黏度可能阻止了右旋糖酐酶與底物的相互作用。

圖3 溫度對右旋糖酐清除率的影響Fig.3 The effect of temperature on the ratio of hydrolysis of dextran

圖4 反應(yīng)時間對右旋糖酐清除率的影響Fig.4 The effect of reaction time on the ratio of hydrolysis of dextran

2.3 正交試驗

正交試驗結(jié)果分析見表2。

根據(jù)表2的極差分析，影響右旋糖酐水解的因素主次為酶劑量＞反應(yīng)溫度＞pH值＞反應(yīng)時間。右旋糖酐酶水解甘蔗汁中右旋糖酐的最優(yōu)條件：酶劑量0.10 U/mL甘蔗汁、pH 6.5、反應(yīng)溫度50℃、反應(yīng)時間20 min。在該條件下，可以清除甘蔗汁中83%的右旋糖酐。因此，海洋細(xì)菌KQ11右旋糖酐酶在制糖工業(yè)中具有應(yīng)用潛力。

圖5 酶劑量對右旋糖酐清除率的影響Fig.5 The influence of enzyme dosage on the ratio of hydrolysis of dextran

表2 正交試驗結(jié)果分析Table 2 Analysis of orthogonal experiment

2.4 超聲對清除右旋糖酐的研究

超聲時間對右旋糖酐清除率的影響見圖6。

圖6 超聲時間對右旋糖酐清除率的影響Fig.6 The influence of ultrasonic power on the hydrolysis of dextran

由圖6可知，超聲處理對右旋糖酐酶清除右旋糖酐的效果十分顯著。在酶劑量0.10 U/mL甘蔗汁，pH 6.5，反應(yīng)溫度50℃，超聲功率300 W的條件下處理1 min就可清除81.3%的右旋糖酐，當(dāng)在該條件下處理5 min，清除率達(dá)到了85%，比正交試驗的最優(yōu)條件清除率更高，所用時間更短。當(dāng)超聲輔助處理15 min，右旋糖酐清除率達(dá)到87.1%，比正交試驗的結(jié)果提高了4.1%。超聲功率對右旋糖酐清除率的影響見圖7。

圖7 超聲功率對右旋糖酐清除率的影響Fig.7 The influence of ultrasonic time on the hydrolysis of dextran

如圖7所示，超聲功率對清除右旋糖酐的影響非常明顯。600W處理15min時的清除率遠(yuǎn)高于200W和400 W，為88.7%，比正交試驗的清除率提高了5.7%。經(jīng)檢測，此時甘蔗汁黏度為4.0 mPa·s，而處理前甘蔗汁粘度為5.0 mPa·s，降低了20%。超聲能夠促進(jìn)右旋糖酐酶與底物的結(jié)合，而不影響酶的活性[5]。建議在甘蔗制糖企業(yè)的前處理工序安裝超聲變幅桿。

3 結(jié)論

海洋氧化節(jié)桿菌KQ11右旋糖酐酶能夠清除甘蔗汁中右旋糖酐。清除右旋糖酐的最優(yōu)條件如下：酶劑量0.1 U/mL甘蔗汁、pH 6.5、反應(yīng)溫度50℃、反應(yīng)時間20 min。在該條件下可以清除83%的右旋糖酐。超聲可以提高右旋糖酐清除率。在酶劑量0.10 U/mL甘蔗汁、pH 6.5、反應(yīng)溫度50℃、超聲功率600 W、超聲時間15 min的條件下，右旋糖酐清除率可達(dá)到88.7%，甘蔗汁粘度降低20%。目前商業(yè)化的右旋糖酐酶主要來自國外進(jìn)口，價格昂貴。一些研究者通過甲醇誘導(dǎo)畢赤酵母工程菌獲得外源右旋糖酐酶。但是甲醇是易燃易爆物，存在安全隱患，而且甲醇具有毒性，作為誘導(dǎo)劑加入發(fā)酵液會在產(chǎn)物中殘留，增加處理和檢測成本。海洋細(xì)菌KQ11發(fā)酵簡單，生產(chǎn)安全，無需加入有害誘導(dǎo)劑，對環(huán)境溫和。海洋細(xì)菌KQ11右旋糖酐酶與超聲聯(lián)合使用的方法在清除甘蔗汁中右旋糖酐的效果上有著明顯優(yōu)勢，安全無害，清除率更高，作用時間更短。建議在糖廠制糖壓榨甘蔗汁階段可使用海洋細(xì)菌KQ11右旋糖酐酶，同時安裝超聲變幅桿，增設(shè)超聲處理。本研究為右旋糖酐酶在制糖工業(yè)上的應(yīng)用提供了參考。