徐 萍， 應(yīng)春妹， 方 筠

（1.復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院檢驗科 上海 200000；2.上海國際旅行衛(wèi)生保健中心，上海 200011）

全球不孕不育的發(fā)病率約為育齡夫婦的9%，并有逐年升高的趨勢[1]。導(dǎo)致不孕癥的原因多種多樣，包括排卵障礙、輸卵管阻塞、子宮內(nèi)膜異位癥、少弱精子癥、畸形精子癥以及免疫性不孕等。根據(jù)病因，采取的治療措施有藥物治療、手術(shù)治療、免疫治療等。 隨著生殖免疫研究的深入，免疫因素和不孕不育的關(guān)系越來越受到關(guān)注。免疫功能異?？赡軐?dǎo)致妊娠各個環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題，從而影響正常受孕以及胎兒發(fā)育。自身抗體的存在反映了機體自身免疫狀態(tài)的異常。抗核抗體（antinuclear antibody，ANA）被認(rèn)為是引起不孕癥、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)等一些婦科疾病的重要因素[2]。目前，一般采用間接免疫熒光法（indirect immunofluorescence，IIF）檢測ANA，采用免疫印跡法（immunoblotting，LIA）檢測ANA譜，2種檢測結(jié)果不完全一致。ANA檢測覆蓋抗體較多，ANA譜檢測只針對特異性抗體，通過確定靶抗原準(zhǔn)確診斷自身免疫病類型。本研究旨在通過分析血清中的ANA及ANA譜情況，尋找不孕病因，從而幫助臨床制定有針對性的治療方案。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2016年1月1日—2017年12月31日在復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院就診的2 939例婦科不孕婦女（實驗組），年齡28～38歲。根據(jù)“女性不孕診斷和評估指南”[3]確定入組條件：（1）原發(fā)或繼發(fā)不孕，不孕期＞1年；（2）女方基礎(chǔ)體溫是雙相，卵巢功能正常；（3）婦科檢查女方無器質(zhì)性病變和輸卵管堵塞；（4）男方精液常規(guī)檢查正常。另選取同期生產(chǎn)正常嬰兒、無不良孕產(chǎn)史的308名女性為對照組。所有研究對象無自身免疫性疾病史。

1.2 儀器與試劑

EUROBlotMaster II全自動免疫印跡儀（德國歐蒙公司）及相應(yīng)試劑。

1.3 方法

采用IIF檢測ANA，采用LIA檢測ANA譜[抗核糖核蛋白（nuclear ribonucleoprotein，nRNP）抗體、抗史密斯（Smith，Sm）抗體、抗天然干燥綜合癥A（Sj?gren syndrome A，SS-A）抗體、抗干燥綜合癥A Ro 52型（Sj?gren syndrome A Ro 52，SSA/Ro 52）抗體、抗干燥綜合癥B（Sj?gren syndrome B，SS-B）抗體、抗硬皮病70（scleroderma-70，SCL-70）抗體、抗皮肌炎-系統(tǒng)硬化癥（polymyositis-sclerosis，PM-Scl）抗體、抗組氨酰轉(zhuǎn)運RNA合成酶（aminoacyl tRNA synthase，Jo-1）抗體 、抗著絲點蛋白B（centromere protein B，CENP-B）抗體、抗增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗體、抗雙鏈DNA（double stranded DNA antibody，ds-DNA）抗體、抗核小體抗體（antinucleosome antibody，AnuA） 、抗組蛋白抗體（anti-histone antibody，AHA）、抗核糖體P蛋白抗體 （Anti-ribosomal P protein antibody，ARPA）、抗線粒體M2抗體（anti-mitochond rial antibody subtype M2，AMA-M2）]。操作步驟和結(jié)果判定嚴(yán)格按儀器說明書進行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件對實驗組和對照組ANA及ANA譜陽性率進行χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ANA檢測結(jié)果

實驗組2 939例血清樣本中檢出ANA陽性316例，陽性率為10.75%；對照組308例血清樣本中檢出ANA陽性6例，陽性率為1.95%。實驗組與對照組陽性率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=24.19，P＜0.01）。

2.2 ANA滴度分布

實驗室與對照組抗體滴度占比最高的均為1∶100，分別占59.81%和83.33%。對照組中無1∶1000抗體滴度。見表1。

表1 實驗組與對照組ANA陽性樣本抗體滴度分布[例（%）]

2.3 ANA核型分布

在熒光顯微鏡下觀察，ANA陽性時因靶抗原在細(xì)胞內(nèi)所處位置的不同而表現(xiàn)不同的熒光染色模型，有均質(zhì)型、核仁型、顆粒型、胞漿型、核點型、著絲點型。實驗組與對照組，較常見的核型均為顆粒型，分別為64.24%和83.33%，且對照組僅有顆粒型和均質(zhì)型，見表2。實驗組和對照組顆粒型核型比例比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.939，P＞0.05）。

表2 實驗組與對照組ANA核型分布 [例（%）]

2.4 ANA譜檢測結(jié)果

實驗組2 939例血清樣本中共檢出ANA譜陽性420例，陽性率為14.29%。對照組308例血清樣本中，共檢出ANA譜陽性14例，陽性率為4.55%。實驗組與對照組ANA譜陽性率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=22.86，P＜0.01）。

2.5 ANA與ANA譜檢測結(jié)果比較

實驗組ANA的陽性率為10.75%（316/2 939），ANA譜的陽性率為14.29%（420/2 939）。其中ANA與ANA譜均陽性136例，均陰性2 339例；僅ANA陽性而ANA譜陰性180例，僅ANA譜陽性而ANA陰性284例；2種方法聯(lián)合檢測，陽性率達(dá)到20.42%（600/2 939），總體符合率為84.21%。

對照組ANA陽性率為1.95%（6/308），ANA譜陽性率為4.55%（14/308），無二者均陽性者，2種方法聯(lián)合檢測的陽性率為6.49%（20/308），總體符合率為93.50%。

實驗組2種方法聯(lián)合檢測的陽性率顯著高于對照組（χ2=34.98，P＜0.01）。

2.6 ANA譜抗體類型分布

實驗組420例ANA譜陽性樣本中存在1種或幾種ANA譜抗體陽性，各種抗體檢出頻次總數(shù)為547例次，其中抗SS-A抗體和抗Ro-52抗體百分比居前2位，分別為23.03%和14.99%。見表3。

本研究對照組ANA陽性者中，LIA法檢測ANA譜均為陰性。ANA陰性者中，14例ANA譜陽性，共計檢出15個陽性抗體。ANA檢測陰性而ANA譜檢測陽性者，多為抗SS-A抗體及抗Ro-52抗體陽性。實驗組與對照組抗SS-A抗體陽性率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.108，P=0.758）。其他抗體類型由于對照組樣本覆蓋較少，有待進一步研究。

表3 實驗組與對照組ANA譜抗體類型分布

3 討論

對于ANA與不孕癥關(guān)系的研究，早在1999年就有報道，LUCENA等[4]報道不孕患者ANA陽性檢出率為17.7%。有文獻報道正常人群ANA陽性率為1.82%～6.00%[5-6]，本研究實驗組與對照組的陽性檢出率分別為10.75%和1.95%，與文獻基本一致。表明不孕與ANA有關(guān)。

IIF法篩查ANA易導(dǎo)致以抗SS-A、抗SS-B和抗Ro-52抗體為主要抗體的患者ANA假陰性。而LIA法檢測ANA譜，雖然特異性較好，但因檢測的抗體不全面也無法取代IIF法用以檢測ANA。本研究結(jié)果表明在不孕患者ANA篩查中，應(yīng)用2種方法聯(lián)合檢測，可提高篩查的敏感性。

本研究實驗組與對照組ANA陽性樣本抗體滴度均主要為1∶100，較陳水綿等[7]報道的1 905例自身免疫性疾病患者，除強直性脊柱炎患者ANA滴度中位數(shù)為1∶80外，系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征、炎性肌病、原發(fā)性硬皮病等患者，ANA滴度中位數(shù)均＞1∶160低。表明存在免疫異常的不孕患者，ANA水平較自身免疫性疾病患者低。此類患者多無明顯癥狀，容易被忽視，當(dāng)不孕時才發(fā)現(xiàn)ANA陽性，其ANA滴度及癥狀達(dá)不到臨床對自身免疫性疾病的診斷及治療標(biāo)準(zhǔn)，而這些抗體的存在，可能是不孕的病因，采取針對性治療或可增加妊娠率。

目前關(guān)于不孕人群ANA核型的報道很少，自身免疫性疾病患者檢測ANA核型，以顆粒型與均質(zhì)型較為常見，本研究實驗組和對照組ANA陽性核型也以顆粒最為常見。ANA核型與不孕癥的關(guān)系還有待進一步研究。

本研究結(jié)果表明，ANA陰性、ANA譜陽性者中，多為抗SS-A抗體及抗Ro-52抗體陽性，ANA檢測可能對這些抗體覆蓋不全面。實驗組與對照組ANA譜檢測抗SS-A抗體構(gòu)成比相當(dāng)。有研究發(fā)現(xiàn)，ARPA、抗Jo-1抗體和抗dsDNA抗體會導(dǎo)致孕婦早期流產(chǎn)[8]，ANA譜檢出各類抗體與不孕的關(guān)系有待進一步研究。

探究ANA對妊娠的影響機制，可能為自身免疫因素影響生育能力，而導(dǎo)致不孕。這類患者自身免疫性因素可能與不孕癥和妊娠損失機制相關(guān)，但由于自身免疫癥狀不明顯而未引起足夠重視。無論是否存在臨床顯性自身免疫性疾病，血清自身抗體如抗磷脂、抗甲狀腺或ANA的存在均可能與不孕癥有關(guān)。自身免疫因素，可能影響所有生育階段，如：通過睪丸衰竭、卵巢衰竭等導(dǎo)致受孕或植入失敗。在臨床實踐和相關(guān)研究中，除了系統(tǒng)性紅斑狼瘡等少數(shù)疾病情況外，自身免疫狀況對生殖健康的影響大多被忽視[9]。因此，對于不明原因不孕不育患者，免疫相關(guān)因素篩查應(yīng)包括ANA等自身抗體篩查。

ANA導(dǎo)致不孕不育，可能與ANA是一組將自身真核細(xì)胞的各種成分脫氧核糖核蛋白、DNA、可提取的核抗原和RNA等作為靶抗原的自身抗體有關(guān)。ANA可以穿透細(xì)胞膜進入活細(xì)胞中，產(chǎn)生抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，中斷細(xì)胞有絲分裂的進程，使得DNA合成受阻[10]，因此ANA的存在，可對卵母細(xì)胞成熟和胚胎分裂造成影響，胚胎在種植前遭到了ANA的攻擊，這也使得胚胎種植失敗。也有可能ANA的存在影響了子宮內(nèi)膜的生長，導(dǎo)致胚胎著床和發(fā)育受阻。針對這一病因，可采用相應(yīng)的治療。有研究結(jié)果表明，對自身抗體陽性患者給予強的松和阿司匹林治療后，可顯著提高胚胎種植率和臨床妊娠率[11]。對不孕者進行ANA與ANA譜檢查，有利于明確病因，并盡早針對性治療。