李建榮 蔣曉帆 張磊 岳康異 黑悅

(空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 710032)

缺血性腦卒中(ischemic stroke, IS)后神經(jīng)元不僅發(fā)生凋亡與壞死，還可發(fā)生自噬。目前研究發(fā)現(xiàn)，IS后自噬水平增高，同時(shí)一類線粒體去乙酰化酶在神經(jīng)元損傷后表達(dá)亦增高[1-3]。沉默信息調(diào)節(jié)因子3(silent information regulator, SIRT3)是線粒體的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD)依賴的去乙?；讣易宄蓡T，廣泛存在于線粒體基質(zhì)和細(xì)胞核中[4-5]。我們推測SIRT3可能通過調(diào)控線粒體自噬影響IS后皮層缺血區(qū)細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸[6]。SIRT3定位于線粒體，在肝臟、心肌、大腦等高表達(dá)[7-8]。然而，SIRT3在缺血性腦卒中如何發(fā)揮作用及其機(jī)制，目前尚未得到明確肯定。

為了進(jìn)一步研究SIRT3對小鼠缺血再灌注模型皮層區(qū)域神經(jīng)元細(xì)胞自噬及凋亡的影響，本研究使用小鼠大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)法建立腦缺血再灌注損傷模型，取再灌注3 h、24 h、3 d、7 d四個(gè)時(shí)間點(diǎn)，利用免疫熒光和蛋白印跡法觀察LC3和SIRT3的共定位以及損傷后的變化趨勢情況，分析兩者的相關(guān)性。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動物和分組

全部健康成年C57BL/6J小鼠(20～22 g)32只，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為4組，即腦缺血再灌注3 h、24 h、3 d、7 d組，每組8只。實(shí)驗(yàn)過程中如遇死亡則另行補(bǔ)齊。

二、小鼠腦缺血再灌注模型的制作

術(shù)前12 h禁食不禁水，用腹腔麻醉(10%水合氯醛，3 mg/kg)麻醉小鼠，游離左側(cè)頸總動脈(common carotid artery, CCA)、頸外動脈(external carotid artery, ECA)和頸內(nèi)動脈(internal carotid, ICA)，結(jié)扎ECA和CCA近心端，動脈夾夾閉CCA遠(yuǎn)端，在CCA結(jié)扎與夾閉兩處之間用動脈剪剪一小口，將浸于肝素生理鹽水中的尼龍線栓(頭端直徑為0.23 mm)沿CCA插入ICA，約12 mm，然后結(jié)扎頸總動脈固定線栓，然后縫合皮膚。整個(gè)手術(shù)過程中室溫保持在22～25 ℃。術(shù)后將動物置于放有清潔墊料的飼養(yǎng)盒中，自由飲水、進(jìn)食。

三、間接免疫熒光染色

5組中各取3只進(jìn)行染色。無痛麻醉后剪開腹腔暴露心臟，以200 mL生理鹽水灌注后用4%多聚甲醛灌注固定。常規(guī)石蠟包埋，冠狀切片(厚度為2 mm)。石蠟切片常規(guī)脫蠟止水，pH=6.0的檸檬酸修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)漂洗3次，每次6 min；加入0.3% H2O2溶液封閉內(nèi)源性過氧化酶15 min；PBS漂洗3次，每次6 min；加入驢血清封閉1 h后甩去血清分別加入兔抗SIRT3(1 ∶500，Abcam，美國)和 小鼠抗LC3(1 ∶500，Sigma，美國)抗體，在4 ℃冰箱中賦予過夜，洗脫。滴加熒光二抗(Invitrogen，1 ∶2 000，山羊抗兔和山羊抗小鼠)孵育3 h，洗去二抗并孵育4, 6-二脒基-2-苯基吲哚(4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride, DAPI)染色液10 min，在熒光顯微鏡下觀察分析。觀察采用單盲、雙人分析單個(gè)低倍鏡下(×20)陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)(取10個(gè)切片×10個(gè)視野的平均數(shù))。

四、皮層區(qū)域蛋白樣品制備和蛋白印跡檢測

提取皮層核心缺血區(qū)蛋白樣品，蛋白裂解液冰上裂解15 min后，4 ℃ 12 000 r/m離心30 min。BCA蛋白定量后-20 ℃保存待用。分別取60 μg各組蛋白樣品進(jìn)行蛋白電泳(10% SDS-PAGE)和轉(zhuǎn)模(NC膜)。與LC3(1 ∶2 000)、SIRT3(1 ∶400)、β-Actin(兔抗，1 ∶2 000，Abcam，USA)抗體結(jié)合過夜，然后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1 ∶20 000)結(jié)合孵育1.5 h，顯色壓片后使用Gel-Pro analyzer軟件進(jìn)行圖像分析。

五、統(tǒng)計(jì)分析

圖1 不同時(shí)間點(diǎn)小鼠皮層損傷區(qū)域SIRT3和LC3表達(dá)的免疫熒光變化 (DAPI, ×200)

Fig 1 The expression of SIRT3 and LC3 in the damage part of cortex of mouse at different times using immunofluorescence (DAPI, ×200)

A: The expression of SIRT3 (green) and LC3 (red) at 3 h, 24 h, 3 d and 7 d; B: The quantification of the expression of SIRT3; C: The quantification of the expression of LC3.

aP<0.05,vs3 h (SIRT3);bP<0.05,vs3 h (LC3).

N=3 per group. Scale bar=40 μm.

結(jié) 果

一、間接免疫熒光

建立小鼠模型后取再灌注3 h、24 h、3 d、7 d四個(gè)時(shí)間點(diǎn)，觀察小鼠急性期大腦皮層損傷核心區(qū)域SIRT3和LC3的表達(dá)，如圖1所示。SIRT3表達(dá)在損傷過程中呈現(xiàn)動態(tài)上調(diào)，拋物線狀變化。再灌注24 h達(dá)到高峰(P<0.01vs3 h)，3 d時(shí)緩慢下降，但仍較3 h表達(dá)較高(P<0.05vs3 h)。LC3亦呈現(xiàn)相似改變，于24 h達(dá)到高峰(P<0.01vs3 h)，3 d時(shí)緩慢下降，但仍較3 h表達(dá)較高(P<0.05vs3 h)。另外，兩者表達(dá)存在共定位現(xiàn)象。

二、蛋白印跡

收集4組蛋白樣品后，同樣觀察缺血再灌注后3 h、24 h、3 d、7 d四個(gè)時(shí)間點(diǎn)的SIRT3和LC3的蛋白表達(dá)變化趨勢，如圖2所示。SIRT3表達(dá)在損傷過程中呈現(xiàn)動態(tài)上調(diào)，拋物線狀變化。再灌注24 h達(dá)到高峰(P<0.01vs3 h)，3 d時(shí)緩慢下降，但仍較3 h表達(dá)較高(P<0.05vs3 h)。LC3亦呈現(xiàn)相似改變，于24 h達(dá)到高峰(P<0.01vs3 h)。

三、Spearman相關(guān)性分析

取小鼠缺血再灌注3 h，24 h，3 d，7 d四個(gè)時(shí)間點(diǎn)的SIRT3(此為參數(shù)x1)和LC3(此為參數(shù)y1)陽性細(xì)胞數(shù)，采用Spearman相關(guān)性分析，得出r=0.6887,P=0.0065<0.01。另外，取3 h、24 h、3 d、7 d四個(gè)時(shí)間點(diǎn)的SIRT3(此為參數(shù)x2)和LC3(此為參數(shù)y2)的相對灰度值，再次采用Spearman相關(guān)性分析，得出r=0.7039,P=0.0050<0.01，再次顯示兩者具有顯著正相關(guān)。由此得出兩者表達(dá)具有顯著相關(guān)性。

圖2 不同時(shí)間點(diǎn)小鼠皮層損傷區(qū)域SIRT3和LC3表達(dá)的蛋白印跡分析

Fig 2 The protein expression of SIRT3 and LC3 in the core damage part of cortex of mouse at different time points using Western blotting

A: The expression of SIRT3 and LC3 at 3 h, 24 h, 3 d, 7 d; B: The quantification of the expression.

aP<0.05,vs3 h (SIRT3);bP<0.05,vs3 h (LC3).

N=3 per group.

討論

缺血性腦卒中占全部腦卒中病例的75%以上，幸存者往往伴有不同程度的神經(jīng)功能障礙，給個(gè)人及社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)，近30年來，IS后腦缺血損傷機(jī)制及腦保護(hù)作用研究成為世界性的難點(diǎn)和熱點(diǎn)問題[9]。而IS后皮層缺血區(qū)域細(xì)胞不僅發(fā)生凋亡與壞死，還可發(fā)生自噬[10]。已有研究證實(shí)，原代培養(yǎng)的神經(jīng)元損傷模型中，傷后1 h、3 h、6 h、12 h 和24 h 作為觀察時(shí)間點(diǎn)，自噬相關(guān)分子LC3Ⅱ和Beclin-1的表達(dá)隨時(shí)間變化逐漸增高[2]。而在早期氧糖剝奪/再灌注應(yīng)激情況下，細(xì)胞會啟動自噬機(jī)制來清除受損線粒體，這時(shí)自噬足以避免大量凋亡因子釋放進(jìn)入胞質(zhì)，對細(xì)胞起到一定保護(hù)作用[2,11]。

作為自噬的標(biāo)志分子，LC3Ⅱ的表達(dá)的高低與發(fā)生自噬的程度成正比[6]，本研究蛋白印跡結(jié)果表明，LC3Ⅱ和SIRT3在缺血損傷后表達(dá)量逐漸上升，自噬被激活，再灌注24 h達(dá)到峰值后隨著時(shí)間的延長有所下降，但整體仍高于正常對照組。顯然SIRT3在自噬表達(dá)最高時(shí)其表達(dá)量亦最高，并且兩者有共定位表達(dá)。

線粒體自噬是神經(jīng)元自噬的主要形式，在神經(jīng)元轉(zhuǎn)歸中扮演重要角色。而目前研究發(fā)現(xiàn)，SIRT3可以通過多種途徑調(diào)控自噬水平[6,12]，對細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用：①SIRT3可通過去乙?；骖^蛋白O3A (folk head protein 3a, FOXO3a) 進(jìn)而上調(diào)眾多抗氧化酶，包括過氧化氫酶(catalase, CAT)和錳超氧化物歧化酶(Mn-superoxide dismutase, MnSOD)等，增加ROS 清除率[13-14]；也可通過激活異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase, IDH2)和谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase, GDH)，促進(jìn)還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH)生成，NADPH 最終通過還原谷型胱甘肽清除活性氧類成分 (reactive oxygen species, ROS)；②SIRT3 可去乙?；€粒體電子傳遞鏈中的組分，包括復(fù)合輔Ⅰ(NADH脫氫酶)、復(fù)合物Ⅱ(琥珀酸脫氫酶)及復(fù)合物Ⅲ的成分，從而調(diào)節(jié)ROS 的產(chǎn)生[15]。進(jìn)一步，在原代培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元中SIRT3通過抑制線粒體鈣攝取和促進(jìn)線粒體生物發(fā)生發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，SIRT3增加皮層神經(jīng)元對氧化性急性損傷的抵抗能力[13]。總而言之，本研究說明MCAO急性期皮層區(qū)域SIRT3對自噬水平可能的誘導(dǎo)作用，而產(chǎn)生的對神經(jīng)元的保護(hù)。

目前本研究發(fā)現(xiàn)：①小鼠腦缺血再灌注損傷模型中，皮層區(qū)域SIRT3表達(dá)先增高后降低，呈拋物線狀；②自噬相關(guān)蛋白LC3-2的表達(dá)與SIRT3呈現(xiàn)相關(guān)性(Spearman相關(guān)性分析,P<0.05)，均在24 h呈現(xiàn)高峰；③免疫熒光發(fā)現(xiàn)LC3-2和Sirt3有共定位表達(dá)。而SIRT3和LC3之間的如何聯(lián)系尚未可知。下一步實(shí)驗(yàn)將調(diào)控SIRT3表達(dá)(過表達(dá)或抑制)進(jìn)一步證實(shí)LC3以及細(xì)胞凋亡的相應(yīng)變化，闡明兩者的潛在的聯(lián)系和分子信號通路。