彭真汾，王 威，葉清華，陳清西*

（福建農(nóng)林大學園藝學院，福建 福州 350002）

氨基酸具有抗菌[1]、保肝保腎[2]、降血脂[3]等作用，可分為水解氨基酸和游離氨基酸，其中水解氨基酸以結合態(tài)形式存在于肽和蛋白質(zhì)中，主要體現(xiàn)物質(zhì)的營養(yǎng)狀況[4-5]；游離氨基酸以游離態(tài)存在，一方面可通過呈味氨基酸反映物質(zhì)口感和風味，以及藥用氨基酸反映藥用價值[4,6-7]；另一方面，通過其在逆境中游離氨基酸含量特別是脯氨酸含量反映植物抗逆性強弱[8]。因此，食物氨基酸含量、種類和比例是評價其營養(yǎng)價值優(yōu)劣的主要指標之一，是對其營養(yǎng)品質(zhì)和風味均有重要貢獻的成分[9]。

橄欖（Canarium album（Lour.）Raeusch.）為橄欖科（Burseraceae）橄欖屬（Canarium）植物，又名青果、青欖、白欖，屬熱帶、亞熱帶果樹[10]，是福建省名特優(yōu)水果，果實營養(yǎng)價值高，富含VC和鈣質(zhì)[11-12]，同時具有很高的藥用價值，能達到生津止渴[10]、解酒保肝[13]等功效，是一種藥食兩用的水果[16]。目前，橄欖氨基酸的研究多集中于成熟時期果實水解氨基酸的變化[11,14-16]，對其成熟過程氨基酸含量變化及游離氨基酸的研究較少。用于測定氨基酸含量的常見方法有分光光度計法[17]、氨基酸自動分析儀法[18]和液相色譜法[19-21]等。分光光度法操作簡單方便，但其只能測定某種氨基酸或一類氨基酸，不能進行氨基酸分離[17]；氨基酸自動分析儀是一種專門測定氨基酸含量的儀器，能同時測定多種氨基酸，但其價格昂貴、用途單一且需對氨基酸進行柱后衍生，存在一定局限性；液相色譜法包括柱前、柱后衍生法和直接測定法，3 種方法均能對氨基酸進行分離測定，但柱前和柱后衍生法會對檢測結果產(chǎn)生一定影響，因此直接法具有一定的優(yōu)勢，其中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜是直接法中的一種[22]。故本研究選擇普通橄欖‘長營’和清橄欖‘清欖1號’2 個不同風味的橄欖品種，通過高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定其成熟過程水解氨基酸和游離氨基酸組分與含量，從氨基酸組分方面分析其對2 個橄欖品種營養(yǎng)品質(zhì)和風味的貢獻，為今后鮮食橄欖品種選育與果實品質(zhì)調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘長營’、‘清欖1號’橄欖果實采于福建省閩清縣久源橄欖專業(yè)合作社，于花后30 d開始采摘，每20 d采摘一次，共9 次。

乙腈、甲酸、甲醇（均為色譜級） 德國Merck公司；乙酸銨（色譜級）、20 種氨基酸標準品：甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、絲氨酸（Ser）、脯氨酸（Pro）、纈氨酸（Val）、蘇氨酸（Thr）、半胱氨酸（Cys）、亮氨酸（Leu）、異亮氨酸（Ile）、天冬酰胺（Asn）、天冬氨酸（Asp）、谷氨酰胺（Gln）、賴氨酸（Lys）、谷氨酸（Glu）、甲硫氨酸（Met）、組氨酸（His）、苯丙氨酸（Phe）、精氨酸（Arg）、酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Trp） 美國Sigma公司；0.22 μm型尼龍、聚醚砜一次性過濾器 天津津騰實驗設備有限公司；鹽酸、無水乙醇均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

Xevo TQ-S高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Waters公司；LGJ-25C型冷凍干燥機 北京四環(huán)科學儀器廠有限公司；FW177型中草藥粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；Allegra 64R型臺式高速冷凍離心機美國貝克曼庫爾特公司；DK-S22型電熱恒溫水浴鍋、DHG-9240A型恒熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司；MNT-2800D型氮吹儀 天津奧特賽恩斯有限公司；RV10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的制備

先將每個氨基酸標準品用甲醇溶液配制成不同濃度儲備液。吸取一定體積儲備液，用70%甲醇溶液定容至10 mL，配為混標液。再吸取混標液100、200、500 μL和800 μL，用70%甲醇溶液分別定容至1 000 μL，得到4 個濃度標準溶液，分別稀釋10、100、1 000 倍，共獲得17 個不同濃度標準溶液。

1.3.2 橄欖粉末的制備

將新鮮采下的橄欖用4 ℃保溫箱帶回實驗室，立即洗凈、晾干、取果肉，凍干并粉碎至過40 目篩后保存于－40 ℃冰箱。

1.3.3 橄欖果實水解氨基酸樣品的提取

參考GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸含量的測定》[23]并略有改進。稱取橄欖粉末0.25 g（精確至0.000 1 g）于水解管中，加入5 mL 6 mol/L HCl溶液，充分浸透粉末，避免黏壁，用氮吹儀充氮氣10 min后瓶塞封口，置于110 ℃烘箱中水解24 h，冷卻，過濾，吸取1 mL上清液用蒸餾水稀釋5 倍，吸取稀釋液3 mL置于水浴鍋上反復蒸干8 次（每次用2 mL蒸餾水），用2 mL蒸餾水沖洗干樣后過0.22 μm聚醚砜過濾器作為橄欖果實水解氨基酸樣品。

1.3.4 橄欖果實游離氨基酸樣品的提取

稱取橄欖粉末0.5 g（精確至0.000 1 g）于50 mL離心管中，加入60%乙醇溶液20.5 mL，在超聲功率270 W、超聲溫度50 ℃條件下超聲提取20 min，后在常溫下10 000 r/min離心10 min，過0.22 μm尼龍過濾器作為橄欖果實游離氨基酸樣品。

1.3.5 色譜條件

色譜柱：Merck ZIC-pHILIC（100 mm×2.1 mm，5 μm）；柱溫：40 ℃；流速：0.4 mL/min；進樣室溫度：10 ℃；進樣量：2 μL；流動相A：5 mmol/L乙酸銨溶液；流動相B：0.1%甲酸-乙腈溶液；梯度洗脫程序：0～13 min 5% A，13～15 min 5%～60% A，15～20 min 60%～5% A。

1.3.6 質(zhì)譜條件

表1 20 種氨基酸的質(zhì)譜條件Table 1 Mass spectrometric conditions for 20 amino acids

離子源：電噴霧正離子模式；監(jiān)測方式：多反應監(jiān)測；離子源溫度：150 ℃；毛細管電壓：1.00 kV；錐孔電壓：30 V；錐孔氣（N2）流量：150 L/h；脫溶劑氣（N2）流量：800 L/h；脫溶劑溫度：400 ℃；碰撞氣（Ar）流速：0.13 mL/min；定量方式：外標法。其他質(zhì)譜條件如表1所示。

1.3.7 氨基酸評價指標的計算[24-26]

氨基酸比值（ratio of amino acid，RAA）、氨基酸比值系數(shù)（ratio coefficient，RC）、氨基酸比值系數(shù)分（score of ratio coefficient，SRC）、含量閾值比（ratio of content and taste threshold，RCT）分別按公式（1）～（4）計算：

式中：SRD為RC相對標準偏差； 為氨基酸RAA的平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)整理和圖表制作采用Excel 2013軟件，顯著性分析采用SPSS 17.0軟件，儀器控制、數(shù)據(jù)采集軟件為Masslynx V4.1 SCN905；數(shù)據(jù)處理軟件（即積分和定量）采用Masslynx中的Targetlynx模式。

2 結果與分析

2.1 氨基酸的線性關系、檢測限和定量限

表2 20 種氨基酸的標準曲線方程Table 2 Standard curves and limits of detection and quantification for 20 amino acids

通過配制不同濃度標準品進行20 種氨基酸標準曲線的制作，由表2可知，20 種氨基酸標準曲線線性關系良好，相關系數(shù)均達到0.97以上。以各氨基酸色譜峰3 倍以及10 倍信噪比分別得出檢測限和定量限，并以定量限線性最高質(zhì)量濃度確定其線性范圍。

2.2 橄欖果實水解氨基酸組分與含量

2.2.1 橄欖果實各發(fā)育時期水解氨基酸含量和組成

通過高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定‘長營’與‘清欖1號’果實從花后30～190 d水解氨基酸組成與含量變化。從表3可知，‘長營’與‘清欖1號’均檢測出16 種氨基酸，其中包括7 種必需氨基酸：賴氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸；9 種非必需氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、組氨酸、精氨酸和酪氨酸。由于本實驗提取水解氨基酸時采用酸水解法，因此色氨酸可能在提取過程中被破壞未檢測出來[27]，半胱氨酸含量低于檢測限而未被檢測出來。總體上，‘長營’和‘清欖1號’果實含量較高的氨基酸為天冬氨酸、絲氨酸、谷氨酸、亮氨酸和賴氨酸。

由表3可知，‘長營’水解氨基酸總量（total amino acid，TAA）最高在花后50 d為16.590 6 mg/g，與花后70 d（16.073 5 mg/g）和花后190 d（15.761 9 mg/g）含量無顯著性差異（P＞0.05）；最低在花后110 d為11.673 9 mg/g，與最高值差異顯著（P＜0.05），整體趨勢為升-降-升，變化較平緩。必需氨基酸（essential amino acid，EAA）含量各時期變化不大，最高在花后50 d為6.105 5 mg/g，最低是花后110 d為4.124 2 mg/g。必需氨基酸與總氨基酸含量比值（EAA/TAA）為30.202 7%～40.676 0%，與40%較為接近，必需氨基酸與非必需氨基酸（non-essential aminoacid，NEAA）比值（EAA/NEAA）為43.272 0%～68.565 8%，與60%相比相近，各時期兩個比值表現(xiàn)為隨著發(fā)育時間的延長，比值與標準差值越來越大，其中以花后30 d與50 d最為接近，達到聯(lián)合國糧農(nóng)及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織（FAO/WHO）推薦的理想蛋白質(zhì)標準[28]，表明‘長營’橄欖隨著發(fā)育逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)闋I養(yǎng)不均衡類型。

由表3可知，‘清欖1號’水解TAA最高是花后190 d，為22.187 3 mg/g，顯著高于其他時期（P＜0.05），最低在花后70 d，為8.759 8 mg/g。整體呈上升趨勢，變幅較大。EAA含量各時期變化不大，最高是花后190 d，為5.646 2 mg/g，最低在花后70 d，為3.548 1 mg/g。EAA/TAA為25.447 9%～40.504 3%，高低差異大，僅花后30、50 d與70 d與40%相近，EAA/NEAA為34.134 6%～68.0795%，變幅大，僅花后30、50 d與70 d與60%接近，其中以花后30、50 d和70 d與FAO/WHO推薦的理想蛋白質(zhì)標準[28]最為接近，花后190 d相差最大，表明‘清欖1號’橄欖隨著發(fā)育逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)闋I養(yǎng)不均衡類型。

因此，‘長營’與‘清欖1號’果實水解氨基酸含量隨著發(fā)育離FAO/WHO推薦的理想蛋白質(zhì)標準越來越遠，表現(xiàn)為營養(yǎng)價值不均衡。以鮮食為主的成熟果花后190 d相比較，‘清欖1號’水解TAA和EAA含量均高于‘長營’，但其EAA/TAA與EAA/NEAA比值均低于‘長營’。

表3 ‘長營’和‘清欖1號’果實不同發(fā)育時期水解氨基酸組成與含量Table 3 Hydrolytic amino acid composition of ‘Changying’ and ‘Qinglan 1 hao’ olives at different developmental stages

2.2.2 EAA與FAO/WHO推薦的氨基酸模式譜的比較

表4 ‘長營’和‘清欖1號’果實不同時期EAA與FAO/WHO推薦氨基酸模式譜比較Table 4 Comparison between essential amino acid composition of‘Changying’ and ‘Qinglan 1 hao’ olives at different developmental stages and FAO/WHO recommended patterns

從表4可知，‘長營’和‘清欖1號’各時期的EAA/TAA與FAO/WHO推薦的氨基酸模式譜[27]相比，除甲硫氨酸與半胱氨酸含量遠低于模式譜標準值，纈氨酸含量略低于模式譜標準值，其余氨基酸均與模式譜推薦值相當，或高于模式譜，其中有一個原因可能是由未檢測出半胱氨酸引起。營養(yǎng)學上把食物中各EAA/TAA與氨基酸模式譜標準值相當?shù)恼J為是營養(yǎng)價值高且均衡的食物，而那些低于氨基酸模式譜的EAA即未達到人體需求比例的EAA稱為限制氨基酸，并根據(jù)其不足差異大小，分為第1限制氨基酸和第2限制氨基酸等[29]。依此，‘長營’和‘清欖1號’各時期的EAA組成和含量均與氨基酸模式譜標準值有一定的差距，營養(yǎng)價值不夠均衡，但屬于人體第1限制氨基酸——賴氨酸含量較高的食物。

2.2.3 SRC法對橄欖果實各發(fā)育時期蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值的評價

RAA及RC越接近1，則表明其EAA含量越接近FAO/WHO推薦值[27]。從表5可知，‘長營’和‘清欖1號’除甲硫氨酸+半胱氨酸RAA和RC值遠低于1，纈氨酸略低于1，其余RAA均接近1。因此，甲硫氨酸和半胱氨酸為‘長營’與‘清欖1號’的第1限制氨基酸。SRC值越接近100，食物中各EAA含量越均衡，營養(yǎng)價值越高[27]。‘長營’與‘清欖1號’SRC值不高，除花后170 d外，其余時期SRC均低于60，表明2 種橄欖果實EAA含量不均衡，導致營養(yǎng)價值不足。此結果與氨基酸模式譜的比較結果相當。

表5 ‘長營’和‘清欖1號’不同發(fā)育時期必需氨基酸的RAA、RC和SRCTable 5 RAA, RC and SRC of essential amino acids in ‘Changying’ and‘Qinglan 1 hao’ olives at different developmental stages

2.3 橄欖果實游離氨基酸組分與含量

2.3.1 橄欖果實各發(fā)育時期游離氨基酸含量和組成

氨基酸具有呈味性[4,30-33]，可分為甜味氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、組氨酸和谷氨酰胺；苦味氨基酸：纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和精氨酸；鮮味氨基酸：賴氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺；芳香族氨基酸：苯丙氨酸、酪氨酸和半胱氨酸。據(jù)其是否有藥用價值，歸為藥用氨基酸：甘氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、谷氨酸[34]。

從表6可知，通過高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測出‘長營’和‘清欖1號’果實各時期均含有19 種氨基酸，其中僅半胱氨酸因含量低于檢測限未測出?！L營’果實游離氨基酸含量總體呈升-降-升-降趨勢，含量最高在花后150 d為10.146 0 mg/g，與花后50 d（10.076 8 mg/g）無顯著性差異（P＞0.05），其他時期含量具有顯著性差異（P＜0.05），最低為花后30 d僅6.493 2 mg/g；呈味氨基酸在花后150 d前以甜味氨基酸含量居高，之后以鮮味氨基酸為主，苦味氨基酸含量降低，芳香族氨基酸略有減少，藥用氨基酸總體在增加?！鍣?號’果實游離氨基酸含量總體呈降-升-降-升趨勢，含量最高在花后190 d為14.542 6 mg/g，與其他時期含量形成顯著性差異（P＜0.05），最低為花后70 d僅5.080 4 mg/g；呈味氨基酸在花后150 d前以甜味氨基酸含量居高，后以鮮味氨基酸為主，苦味氨基酸總體上稍有增加，芳香族氨基酸有所減少，藥用氨基酸總體呈上升趨勢。

表6 ‘長營’和‘清欖1號’果實不同發(fā)育時期游離氨基酸組分與含量Table 6 Free amino acid composition of ‘Changying’ and ‘Qinglan 1 hao’ olives at different developmental stages

‘長營’與‘清欖1號’果實游離氨基酸總量趨勢有所差異。兩者含量較多的氨基酸均為絲氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺。呈味氨基酸均表現(xiàn)出前期甜味氨基酸占比大，后期鮮味氨基酸為主，苦味氨基酸總體變化不大，芳香族氨基酸先增加后逐漸減少，藥用氨基酸含量逐漸增大。以鮮食為主的花后190 d相比，‘清欖1號’果實游離氨基酸含量較‘長營’高出7.137 7 mg/g，‘清欖1號’果實游離氨基酸總量上更具有優(yōu)勢。

2.3.2 橄欖果實不同時期游離氨基酸RCT值

每個氨基酸都有其味覺閾值[4,30-33]，通過其RCT決定其對食物風味的貢獻，并非含量越高其貢獻就越大，當RCT大于1時，此氨基酸對食物具有貢獻，并且RCT值越大，貢獻就越大，否則就對食物風味無貢獻[4]。從表7可知，對‘長營’和‘清欖1號’果實風味貢獻較大的有苦味的精氨酸以及呈鮮味的谷氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺。使‘長營’和‘清欖1號’橄欖具有豐富且獨特口感。其中呈鮮味的谷氨酸和天冬氨酸均隨著果實成熟，含量逐漸上升，貢獻越來越大，使‘長營’和‘清欖1號’果實鮮味濃郁。以食用為主的花后190 d相比，‘清欖1號’橄欖果實鮮味和甜味貢獻大于‘長營’，使‘清欖1號’橄欖更具有鮮甜味，這也許就是造成清橄欖‘清欖1號’鮮食口感優(yōu)于普通橄欖‘長營’的原因之一。

3 討論與結論

橄欖果實氨基酸種類豐富，本實驗中2 個品種橄欖水解氨基酸均測出16 種氨基酸，包括7 種EAA和9 種NEAA，此結果與文獻[11,14,16]測定結果相一致。在EAA含量上，賴氨酸含量高，甲硫氨酸為限制氨基酸，與林玉芳[11]、何志勇[16]結果一致，但其EAA/TAA、EAA/NEAA、EAA與氨基酸模式譜標準及氨基酸評價指標不符合理想?yún)⒖贾?，是一種營養(yǎng)不夠均衡的水果，與何志勇[16]認為的檀香橄欖符合FAO/WHO推薦EAA/TAA及EAA/NEAA比例接近40%和60%結果相左，可能是橄欖品種差異所導致。

表7 ‘長營’和‘清欖1號’不同時期游離氨基酸RCT值Table 7 RCT values of free amino acids of ‘Changying’ and ‘Qinglan 1 hao’ olives at different developmental stages

果實游離氨基酸中呈味氨基酸含量的差異將影響其風味品質(zhì)。魯敏等[5]通過測定無籽刺梨和刺梨中游離氨基酸含量，發(fā)現(xiàn)刺梨中精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和鳥氨酸均對刺梨果實風味形成有貢獻，而無籽刺梨僅天冬氨酸為其鮮味形成作出貢獻，風味品質(zhì)不如刺梨豐富；岳冬等[26]測定櫻桃番茄和普通番茄游離氨基酸含量，發(fā)現(xiàn)櫻桃番茄鮮味、甜味和芳香族氨基酸含量高于普通番茄，表明櫻桃番茄風味品質(zhì)優(yōu)于普通番茄。普通橄欖口味酸澀，多用于加工，鮮食口感不佳；清橄欖口味清淡，回甘良好，品質(zhì)優(yōu)于普通橄欖，更適宜鮮食。本實驗表明普通橄欖‘長營’和清橄欖‘清欖1號’2 個品種橄欖鮮食品質(zhì)有所差異，‘清欖1號’果實鮮、甜味氨基酸貢獻高于‘長營’，表明‘清欖1號’果實鮮甜風味優(yōu)于‘長營’，符合人們對2 種橄欖口感的評價。

普通橄欖‘長營’及清橄欖‘清欖1號’果實水解氨基酸在花后30～190 d均含有16 種氨基酸，包括7種EAA和9 種NEAA，賴氨酸含量高，EAA/TAA、EAA/NEAA比例不符合FAO/WHO推薦值，RAA、RC及SRC值不理想，為氨基酸種類豐富但營養(yǎng)價值不夠均衡的高賴氨酸含量水果。

2 個品種橄欖游離氨基酸均含有19 種氨基酸，前期甜味氨基酸含量高，后期鮮味氨基酸含量高，苦味和芳香族氨基酸略有變化，藥用氨基酸逐漸增高，使各時期表現(xiàn)出不同的風味特點和高藥用價值?？傮w表現(xiàn)為清橄欖‘清欖1號’鮮味（谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺）、甜味氨基酸（谷氨酰胺）貢獻高于普通橄欖‘長營’，風味品質(zhì)優(yōu)于‘長營’。