何述輝 葉淑均 黃楊欽

（重慶市渝北區(qū)畜牧水產(chǎn)站 401120）

口蹄疫病毒是我國強(qiáng)制免疫病種，但口蹄疫疫苗在臨床上免疫效果并不理想。特殊情況下，嚴(yán)格隔離病畜后用中藥治療早期?？谔阋呒膊≈斡士蛇_(dá)80%左右，獲得良好的治療效果[1]。中藥或其有效成分作為免疫增強(qiáng)劑配合疫苗免疫能提高疫苗的免疫效果[2,3]。

1 材料與方法

1.1 主要藥品和試劑

川牛膝多糖提?。捍ㄅＯ?00g、蒸餾水、三氯甲烷、正丁醇、無水乙醇、丙酮。

川牛膝多糖硒酸酯制備：川牛膝多糖粉末、0.5%HNO3、Na2SeO3、BaCl2、碳酸鈉、pH試紙、無水硫酸鈉、抗壞血酸。

小鼠體外注射試驗(yàn)佐劑：試驗(yàn)小鼠50只、口蹄疫疫苗、鋁佐劑、硒酸酯多糖佐劑。

1.2 主要儀器

低速離心機(jī)(0412-1型)：上海手術(shù)器械廠。

隔水式恒溫培養(yǎng)箱（GHP-9160型）：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司。

酶標(biāo)儀（Bio-RAD 680型）：美國伯樂生物技術(shù)公司。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

昆明小白鼠50只，體重18～22g。

1.4 試驗(yàn)方法

川牛膝多糖的提取方法： （1）川牛膝100g研磨碾碎，加入1.2L蒸餾水煮2h，過濾并收集濾液。 （2）將濾液放入燒杯中，置于60℃水浴鍋中濃縮至100ml即得出提取液。 （3）提取液中加入提取液1/4體積的三氯甲烷、1/16體積的正丁醇，震蕩5min，在2000r/min條件下離心15min，如此重復(fù)5次。（4）加入適量的無水乙醇醇沉，靜置過夜，用丙酮、無水乙醇反復(fù)洗滌得到沉淀物，置于烘箱中烘干沉重，即可得到多糖。

川牛膝多糖硒酸酯的制備方法： （1）取川牛膝多糖1g，加入5%HNO3及100ml蒸餾水，水浴加熱至70℃。 （2）分別加入0.8g左右Na2SeO3和1.44gBaCl2在70℃的水浴鍋中靜置加熱6h。 （3）6h后取出冷卻至室溫，過濾，取濾液用無水碳酸鈉調(diào)節(jié)pH=6～7。 （4）加入1.4g無水硫酸鈉入濾液中，振蕩1min，在2000r/min離心，離心15min。 （5）離心后去上清液裝入透析袋中透析，直到用抗壞血酸檢測無紅色為止。 （6）講透析后的藥品置于真空冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥24h得川牛膝多糖硒酸酯，取出并密封保存。 （7）經(jīng)紅外光譜檢測，合成成功。

分組及免疫程序：將小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只。試驗(yàn)分為空白組（Naive）、多糖硒酸酯組（SRCPS）、疫苗組(FMDV)、疫苗+多糖硒酸酯組(FMDV+SRCPS)、疫苗+鋁佐劑組(FMDV+alum)。所有免疫均采取腹股溝皮下注射進(jìn)行免疫，空白組(Naive)小鼠注射生理鹽水（9%NaCl）200μL，多糖硒酸酯組(SRCPS)小鼠注射川牛膝多糖硒酸酯溶液200μL，疫苗組(FMDV)小鼠注射口蹄疫疫苗200μL，疫苗+多糖硒酸酯組（FMDV+SRCPS）小鼠注射口蹄疫疫苗200μL與川牛膝多糖硒酸酯溶液200μL，疫苗+鋁佐劑組(FMDV+alum)小鼠注射口蹄疫疫苗200μL與鋁佐劑200μL，14d后進(jìn)行二免，方法同前。

血清采集及檢測：分別將對(duì)照組及試驗(yàn)組二免后14d時(shí)進(jìn)行眼眶采血1ml/只血樣靜置于4℃冰箱過夜，4000r/min，離心10min，分離出血清供檢測抗體，將血清分裝于0.2ml塑料離心管中，-20℃保存。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 SRCPS對(duì)血清特異性抗體IgG水平的影響

結(jié)果顯示，各組試驗(yàn)小鼠于二免15d后血清中FMDV特異性IgG的水平，各組與FMDV免疫組相比，F(xiàn)MDV+SRCPS組的IgG水平均極顯著高于FMDV組，F(xiàn)MDV+alum組的IgG水平極顯著高于FMDV組，川牛膝多糖硒酸酯能顯著提高口蹄疫特異性IgG的水平。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，與FMDV組相比較，F(xiàn)MDV+alum組與FMDV+SRCPS組的特異性抗體IgG水平差異顯著高于FMDV組。由此可見，川牛膝多糖硒酸酯作為口蹄疫疫苗免疫佐劑能很好地促進(jìn)機(jī)體體液免疫反應(yīng)水平，為進(jìn)一步將川牛膝多糖硒酸酯研究及開發(fā)成新型免疫佐劑提供理論依據(jù)。