張 睿，馮玄燁，王 湘，戴 寧，馮麗莉，趙 欣，蔡大勇，王玥琦*

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京 100029；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193）

陽(yáng)虛血瘀是衰老的重要因素[1]，在外界寒冷刺激下可加重血瘀程度，反復(fù)寒冷刺激可誘導(dǎo)血管產(chǎn)生血瘀的病理變化[2]。血瘀證如得不到恰當(dāng)治療，可加速衰老[3]。若單純以活血化瘀藥治療此時(shí)的血瘀證，會(huì)損傷機(jī)體正氣[4]。因老年人用藥不宜過(guò)偏[5]，本實(shí)驗(yàn)用杞紅液，由平性的枸杞子和微溫的山楂組成，糾正衰老過(guò)程中外寒引起的血管損傷，通過(guò)研究血管內(nèi)皮的損傷與修復(fù)，血液中髓過(guò)氧化物酶活力以及血管纖維沉積量和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1表達(dá)量，觀察杞紅液預(yù)防臭氧吸入聯(lián)合冰水浴誘導(dǎo)大鼠血管纖維化的作用。

1 材料

健康雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量180～200 g，由斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0002。MK3型酶標(biāo)儀（賽默飛世爾（上海）儀器有限公司）；SleeMPS/P2型包埋機(jī)（德國(guó)SLEE公司）；RM2245型石蠟切片機(jī)（德國(guó)Leica）；全自動(dòng)數(shù)字切片掃描系統(tǒng)KF-PRO-005型（寧波江豐生物信息技術(shù)有限公司）。枸杞子：北京同仁堂，批號(hào)20160722，山楂：北京同仁堂，批號(hào)20160712。杞紅液：枸杞子與山楂質(zhì)量比為2:1，由北京中醫(yī)藥大學(xué)關(guān)鍵技術(shù)中心提供。維生素E軟膠囊，規(guī)格：100 mg/粒（批號(hào)160708），天津市中央藥業(yè)有限公司。一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS,批號(hào)20170310），髓過(guò)氧化物酶（myeloperoxidase，MPO，批號(hào)20170315），以上試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所。大鼠血管內(nèi)皮素1ELISA試劑盒（endothelin-1，ET-1，批號(hào)QS-R20247），購(gòu)于賽思博爾（北京）生物科技有限公司。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor beta 1，TGF-β1）抗體，鏈霉親和素-生物素復(fù)合物法免疫組化試劑盒（批號(hào)BA0290），購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。

2 方法

2.1 分組 適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組，模型組，陽(yáng)性藥組，杞紅液低、中、高劑量組。對(duì)照組：連續(xù)28 d每日予以雙蒸水（15 mL/kg）灌胃1次；模型組、陽(yáng)性藥組、杞紅液低、中、高劑量組均于第1天開(kāi)始，持續(xù)28 d隔日置于自制臭氧柜（1.2±0.2 L/m3）內(nèi)染毒4 h[6-7]；第15天開(kāi)始，每日置于0～4 ℃冰水中20 min，水深以沒(méi)過(guò)大鼠身體1/2至2/3為宜，持續(xù)14 d[8]，同時(shí)模型組每日予以雙蒸水（15 mL/kg）灌胃1次，陽(yáng)性藥組予以維生素E軟膠囊（13.5 mg/kg）灌胃1次，杞紅液低、中、高劑量組分別予杞紅液（45、90、180 mg/kg）灌胃1次。第29天腹腔麻醉，腹主動(dòng)脈取血，分離胸主動(dòng)脈。2.2 指標(biāo)檢測(cè)

2.2.1 血清和指標(biāo) 分離血清。嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清NOS、MPO水平。按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清ET-1含量。

2.2.2 組織病理學(xué)、纖維沉積形態(tài)觀察 4%多聚甲醛固定血管，石蠟包埋，4 μm切片，Masson染色，中性樹(shù)膠封片，掃描。KF-PRO-005型掃描系統(tǒng)40倍物鏡下，隨機(jī)獲取每只大鼠5個(gè)視野顯微照片，計(jì)算該照片下血管纖維面積比，以每只大鼠5個(gè)視野血管纖維面積比的平均數(shù)，作為該大鼠的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。采用Image-Pro Plus顯微分析系統(tǒng)，形態(tài)計(jì)量血管膠原纖維面積比。光鏡下，Masson染色膠原纖維藍(lán)染，胞漿紅染。分析各組大鼠血管組織病理變化和血管纖維沉積面積比。

2.2.3 血管免疫組化TGF-β1表達(dá)量 另取蠟塊，3 μm切片，3%過(guò)氧化氫避光孵育1 h，放于微波爐里進(jìn)行枸櫞酸緩沖液抗原修復(fù)，牛血清蛋白封閉后滴加一抗（兔多抗TGF-β1，1:200稀釋）4 ℃孵育16 h，洗脫，滴加二抗（羊抗兔）37 ℃孵育30 min，二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素核復(fù)染，中性樹(shù)膠封片，掃描。光鏡下，TGF-β1在細(xì)胞漿內(nèi)顯黃棕色，形態(tài)計(jì)量，對(duì)比分析各組大鼠血管TGF-β1的表達(dá)量。表達(dá)量＝平均光密度值×（積分光密度值÷平均光密度值×計(jì)量陽(yáng)性細(xì)胞面積）3/2。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，各組數(shù)據(jù)均呈正態(tài)分布時(shí)，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析（F檢驗(yàn)），均數(shù)多重比較采用LSD檢驗(yàn)（方差齊時(shí)）或Tamhane’s T2檢驗(yàn)（方差不齊時(shí)）。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)NOS、MPO活力、ET-1含量的影響 見(jiàn)表1。與對(duì)照組相比，模型組NOS活力下降，MPO活力上升，ET-1含量下降（P＜0.05）；與模型組相比，給藥組NOS活力回升，MPO活力回降（P＜0.05）。杞紅液中、高劑量可明顯回升ET-1（P＜0.05）。

表1 NOS、MPO、ET-1（ ，n = 8）

表1 NOS、MPO、ET-1（ ，n = 8）

注：與對(duì)照組相比，# P＜0.05；與模型組相比，△P＜0.05

組 別 NOS/（U/mL） MPO/（U/L） ET-1/（pg/mL）對(duì)照組 20.49±2.34 28.27±5.35 203.08±27.38模型組 17.07±3.01# 48.43±12.17# 154.37±33.78#陽(yáng)性藥組 21.63±1.59△ 33.43±6.34△ 157.09±16.32#低劑量組 20.13±1.82△ 36.38±7.01#△ 179.61±22.82中劑量組 19.87±1.87△ 35.40±5.90△ 182.14±17.58△高劑量組 20.40±1.80△ 27.53±3.00△ 210.15±8.46△

3.2 對(duì)血管纖維沉積的影響 如圖1、表2所示，膠原纖維主要分布在胸主動(dòng)脈血管的中膜層和外膜層，與對(duì)照組相比，模型組和陽(yáng)性藥組纖維沉積較多（P＜0.05）；與模型組相比，杞紅液低、中、高劑量組均可不同程度緩解纖維沉積（P＜0.05）。

圖1 血管Masson染色（10×40）

3.3 對(duì)血管TGF-β1表達(dá)量的影響 如圖2、表2所示，與對(duì)照組相比，模型組、陽(yáng)性藥組、杞紅液低劑量組TGF-β1在血管的表達(dá)量增加；與模型組相比，杞紅液低、中、高劑量均可不同程度回降TGF-β1在血管中的表達(dá)量。

圖2 血管TFG-β1染色（10×40）

表2 纖維沉積表達(dá)量和TGF-β1在血管中的表達(dá)量（ ，n = 8）

表2 纖維沉積表達(dá)量和TGF-β1在血管中的表達(dá)量（ ，n = 8）

注：與對(duì)照組相比，# P＜0.05；與模型組相比，△P＜0.05

組 別 膠原纖維百分比% TGF-β1表達(dá)量%對(duì)照組 39.02±3.78 0.12±0.08模型組 57.90±8.38# 0.36±0.12#陽(yáng)性藥組 56.59±6.19# 0.34±0.18#低劑量組 47.33±3.91#△ 0.18±0.15△中劑量組 42.28±6.71△ 0.14±0.09△高劑量組 43.90±5.83△ 0.16±0.14△

4 討論

衰老過(guò)程中人體的血管彈性減弱[9]，加上外界寒冷的刺激，血管的脆性增大，纖維化加重，易發(fā)生血管破裂從而引起血管疾病，本實(shí)驗(yàn)用大鼠模擬在臭氧致衰的狀態(tài)下，經(jīng)受外寒的刺激，研究杞紅液對(duì)血管的保護(hù)作用。枸杞子性平味甘，滋補(bǔ)肝腎、益精明目[10]，具有降血脂、保肝、護(hù)肝等生物活性[11]，是治療衰老最常用、最重要的中藥[12]。山楂性溫味酸，消食健胃，行氣散瘀，化濁降脂，所含黃酮類化合物具有抗氧化作用[13]，實(shí)驗(yàn)研究證明，山楂可改善血液循環(huán)，具有活血化瘀作用[14]。

根據(jù)各項(xiàng)結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)臭氧染毒和冰水浴造模后，NOS活力下降，ET-1活力下降，MPO活力上升。NO是擴(kuò)張血管能力最強(qiáng)的血管舒張因子[15]，在體內(nèi)NO由NOS催化而成，NO和NOS的降低會(huì)促使白細(xì)胞黏附、提升低密度脂蛋白向血管壁滲透以及提升平滑肌細(xì)胞增殖，甚至促進(jìn)血小板聚集，而易發(fā)生血管疾病[16]，由于NO半衰期極短，不易于直接檢測(cè)，而研究NOS可以間接反應(yīng)NO的程度。ET-1是收縮血管能力最強(qiáng)的血管收縮因子，通過(guò)激活鈣通道以增加鈣離子內(nèi)流，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞收縮，檢測(cè)干預(yù)前后NOS、ET-1的變化，可了解血管舒張功能[17]。大鼠血清中NOS降低, 可能是由于接觸寒冷刺激, 產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)，而杞紅液通過(guò)提升NOS活力，進(jìn)而促進(jìn)NO的合成，當(dāng)血管受到寒冷刺激時(shí)，保護(hù)細(xì)胞不受侵害。MPO是NO的代謝酶，在病理狀態(tài)下，過(guò)多生成的MPO直接與NO反應(yīng)形成過(guò)NO2-，進(jìn)而導(dǎo)致NO被消耗，MPO與動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)。TGF-β1是一種重要的調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)積聚的細(xì)胞因子，是目前發(fā)現(xiàn)評(píng)價(jià)纖維化最強(qiáng)的因子，也是目前治療器官纖維化的公認(rèn)靶標(biāo)子[18-19]，TGF-β1與狹窄血管數(shù)量呈負(fù)相關(guān)[20]，說(shuō)明降低TGF-β1的含量有可能具有防止動(dòng)脈硬化發(fā)生、發(fā)展的潛在功能。在Masson染色觀察形態(tài)計(jì)量纖維沉積情況下，同時(shí)形態(tài)計(jì)量檢測(cè)TGF-β1，可以直觀反應(yīng)纖維化程度，實(shí)驗(yàn)中杞紅液低、中、高劑量都不同程度改善NOS、MPO活力，改善ET-1含量，可以緩解纖維的沉積，調(diào)節(jié)了血管的應(yīng)激作用，降低了纖維化進(jìn)程。