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(1.常州市第一人民醫(yī)院婦科，江蘇 常州 213000；2.常州市第一人民醫(yī)院綜合實(shí)驗(yàn)室，江蘇 常州 213000)

子宮內(nèi)膜癌是嚴(yán)重威脅女性健康的婦科惡性腫瘤。最近的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率逐年上升，目前發(fā)病率位于婦科惡性腫瘤第4位[1]。子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生與多種因素相關(guān)[2]，睪酮可能是其中一種。睪酮是一種雄性激素，主要由男性的睪丸或女性的卵巢分泌，腎上腺也可以少量分泌[3-4]。睪酮具有多種生理學(xué)功能，但是最近的研究[5-7]表明，睪酮的表達(dá)水平與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后具有高度相關(guān)性，包括心血管疾病、抑郁癥、肥胖以及前列腺癌等。但是目前關(guān)于睪酮與子宮內(nèi)膜癌之間的相關(guān)性未有報(bào)道，因此本研究通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)探索睪酮對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖的影響以及其對(duì)PI3K/mTOR信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響[8]，以此探索子宮內(nèi)膜癌潛在的治療手段。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞來(lái)源子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2主要試劑睪酮購(gòu)自江蘇安特爾醫(yī)療科技有限公司，為口服用膠囊，用時(shí)取膠囊內(nèi)液體進(jìn)行稀釋；CCK-8試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所；B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2相關(guān)X蛋白(Bax)、β-actin、PI3K、mTOR、p-PI3K、p-mTOR兔抗人一抗以及辣根過(guò)氧化物酶(HRP)偶聯(lián)羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)CST公司；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；Total RNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYRB購(gòu)自日本TAKARA公司；DMEM F12培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gbico公司。

1.3方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 常規(guī)培養(yǎng)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞于含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%青鏈霉素混合液的DMEM F12完全培養(yǎng)基中，置于細(xì)胞孵育箱內(nèi)，保持37 ℃恒溫，體積分?jǐn)?shù)5% CO2濃度以及飽和濕度。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞密度，細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%密度進(jìn)行消化傳代。

1.3.2 細(xì)胞增殖檢測(cè)(CCK-8法) 子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞消化重懸后以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，適應(yīng)生長(zhǎng)過(guò)夜后，加入終濃度為10、20、40、80 ng·mL-1的睪酮處理48 h，以未加睪酮的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。加入體積分?jǐn)?shù)10% CCK-8試劑共同孵育3 h后，置于酶標(biāo)儀中在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔吸光度。

細(xì)胞如上鋪板適應(yīng)生長(zhǎng)后，加入終濃度為40 ng·mL-1的睪酮處理7 d，每天同一時(shí)間按照上述方法檢測(cè)1次吸光度值，以未加睪酮的細(xì)胞作為陰性對(duì)照，7 d后繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.3.3 qPCR法檢測(cè) 子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞消化重懸后以5×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，適應(yīng)生長(zhǎng)過(guò)夜后，加入終濃度為40 ng·mL-1的睪酮處理48 h，以未加睪酮的細(xì)胞作為陰性對(duì)照，按照總RNA提取試劑盒說(shuō)明書操作，提取細(xì)胞總RNA。吸光度法檢測(cè)RNA濃度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，構(gòu)建cDNA。加入相應(yīng)試劑和熒光染料SYRB后，用美國(guó)BIO-RED公司實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性15 s；95 ℃變性5 s；65 ℃退火30 s；40個(gè)循環(huán)。最后結(jié)果以2-△△ct進(jìn)行計(jì)算。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。引物序列如下所示：β-actin：上游CTCCATCCTGGCCTCGCTGT，下游GCTGTCACCTTCACCGTTCC；Bax：上游ACCAAGAAGCTGAGCGAGTG，下游CCCAGTTGAAGTTGCCATCA；Bcl-2：上游ACGACTTCTCCCGCCGCTAC，下游CCCAGCCTCCGTTATCCTG。

1.3.4 Western blot 子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞消化重懸后以5×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，適應(yīng)生長(zhǎng)過(guò)夜后，加入終濃度為40 ng·mL-1的睪酮處理48 h，以未加睪酮的細(xì)胞作為陰性對(duì)照，加入相應(yīng)體積的RIPA-PMSF-磷酸酶抑制劑混合液提取細(xì)胞總蛋白。通過(guò)BCA法檢測(cè)蛋白濃度，加入相應(yīng)體積的上樣緩沖液后煮沸5 min變性蛋白，于-20 ℃保存。配制SDS-PAGE凝膠后，以每孔30 μg的上樣量加入變性蛋白溶液進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)移進(jìn)入PVDF膜上，使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%牛血清白蛋白常溫封閉2 h，切膜后分別加入已經(jīng)稀釋完畢的β-actin、Bcl-2、Bax、PI3K、p-PI3K、mTOR、p-mTOR兔抗人一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。TBST清洗3次后加入已經(jīng)稀釋完畢的HRP偶聯(lián)羊抗兔二抗，室溫孵育2 h。用TBST清洗3次后浸泡于TBST中，使用專用的ECL進(jìn)行曝光。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。最終以Actin作為內(nèi)參，統(tǒng)計(jì)各組蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1不同濃度睪酮促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖常規(guī)培養(yǎng)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞后，用不同濃度的睪酮處理，結(jié)果證實(shí)，睪酮以劑量依賴性的方式促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同濃度睪酮對(duì)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖的影響

2.2固定濃度睪酮顯著促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞倍增時(shí)間常規(guī)培養(yǎng)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞后，用40 ng·mL-1的睪酮處理5 d，結(jié)果證實(shí)，睪酮能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，降低其倍增時(shí)間(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 睪酮作用不同時(shí)間對(duì)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖的影響

2.3睪酮對(duì)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響常規(guī)培養(yǎng)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞后，用40 ng·mL-1的睪酮處理48 h，提取總蛋白和總RNA后，檢測(cè)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平。結(jié)果證實(shí)，無(wú)論是在轉(zhuǎn)錄水平還是翻譯水平，睪酮都能夠上調(diào)腫瘤細(xì)胞Bcl-2的表達(dá)水平，而降低Bax的表達(dá)水平。見(jiàn)圖2、表2。

圖2 睪酮對(duì)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

表2 睪酮對(duì)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.4睪酮對(duì)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞PI3K/mTOR信號(hào)通路的影響常規(guī)培養(yǎng)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞后，用40 ng·mL-1的睪酮處理48 h，提取總蛋白后，檢測(cè)PI3K/mTOR信號(hào)通路活化水平。結(jié)果證實(shí)，睪酮能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞PI3K和mTOR的磷酸化(P<0.05)。見(jiàn)圖3、表3。

圖3 睪酮對(duì)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞PI3K/mTO信號(hào)通路蛋白活化的影響

表3 睪酮對(duì)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞PI3K/mTOR信號(hào)通路蛋白活化的影響

注：與陰性對(duì)照組比較，1)P<0.05

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是常見(jiàn)的婦科腫瘤，其發(fā)生與多種因素相關(guān)[9-11]。睪酮在多種惡性腫瘤，尤其是在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展中扮演了重要角色[5,7]。先前的研究[5,7,12]表明高水平的睪酮能夠促進(jìn)前列腺癌的發(fā)生以及骨轉(zhuǎn)移，前列腺癌患者去勢(shì)對(duì)于前列腺癌的治療也具有重要意義。但是睪酮在婦科腫瘤，尤其是子宮內(nèi)膜癌中的意義目前尚無(wú)報(bào)道，本研究旨在證實(shí)兩者之間的聯(lián)系并探索睪酮促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖的效應(yīng)和分子機(jī)制。

子宮內(nèi)膜癌可以分為雌激素受體依賴型以及非依賴型[11]，雌激素受體依賴型以陽(yáng)性表達(dá)雌激素受體為特征。子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞是雌激素受體依賴型子宮內(nèi)膜癌的代表性細(xì)胞株[13-14]，本研究通過(guò)CCK-8法觀察到不同濃度的睪酮能夠提升子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞的增殖。使用固定濃度的睪酮作用于細(xì)胞不同時(shí)間，通過(guò)繪制的生長(zhǎng)曲線可以發(fā)現(xiàn)，睪酮作用后顯著縮短了細(xì)胞倍增時(shí)間，這初步證實(shí)了睪酮與子宮內(nèi)膜癌之間的關(guān)聯(lián)。

蛋白表達(dá)檢測(cè)證實(shí)睪酮作用后顯著上調(diào)了凋亡抑制基因Bcl-2的表達(dá)水平，顯著下調(diào)了凋亡促進(jìn)基因Bax的表達(dá)水平。該結(jié)果提示睪酮可能通過(guò)抑制細(xì)胞的凋亡而促進(jìn)增殖，這與先前研究[15-16]相似。在更進(jìn)一步的研究中，發(fā)現(xiàn)睪酮作用后PI3K/mTOR信號(hào)通路的關(guān)鍵分子p-PI3K和p-mTOR的活化水平顯著上調(diào)，但是PI3K和mTOR的表達(dá)水平未受到影響，因此推測(cè)睪酮通過(guò)激活PI3K/mTOR信號(hào)通路促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)水平，同時(shí)抑制Bax的表達(dá)水平，最終促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞的增殖。