唐娟 劉華棟 陸冰洋 李婷婷 王彩先 丁樹榮 詹麗娥

摘要：針對山西清徐縣某養(yǎng)雞場發(fā)生的雛雞死亡且死亡率不斷升高的情況，筆者通過觀察發(fā)病雞的臨床癥狀、病理剖檢變化，采集組織樣品進(jìn)行分離培養(yǎng)、鑒定培養(yǎng)、染色鏡檢、生化試驗等，并對分離菌使用K-B試紙擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗，采集組織樣品使用新城疫的RT-PCR方法進(jìn)行檢測。結(jié)果表明分離菌為大腸桿菌，藥敏試驗可見其對慶大霉素、氧氟沙星、阿米卡星等藥物敏感。PCR擴(kuò)增出特異性的條帶，確定有新城疫病毒感染。針對這種情況采用疫苗和敏感藥物聯(lián)合使用，病情得到有效控制。

關(guān)鍵詞：新城疫;大腸桿菌;K-B試紙擴(kuò)散法;RT-PCR

清徐縣某雞場于2018年4月26日發(fā)生疫病，42日齡的雛雞出現(xiàn)死亡情況，而且死亡率迅速升高。該雞場養(yǎng)殖此日齡的雛雞200余只。經(jīng)過3d時間，死亡達(dá)到30余只，場主帶了4只剛死亡的雛雞和2只發(fā)病的活雛雞到筆者研究室進(jìn)行疾病診斷。

1臨床癥狀

病雞精神沉郁，縮頭呆立、閉眼、對刺激反應(yīng)遲鈍，飲食廢絕，拉黃綠色的稀便。有一只出現(xiàn)角弓反張的神經(jīng)癥狀。

2病理變化

通過對病雞和死雞進(jìn)行剖檢，可見肝臟和心臟外邊有纖維素性沉淀物，呈現(xiàn)出“包心包肝”的表現(xiàn);氣囊渾濁;腺胃乳頭有散在的出血點，乳頭略有腫大，腺胃和肌胃的交界處也有出血點;脾臟腫大，表面有白色的壞死點;十二指腸有分布不均的出血點，兩側(cè)盲腸扁桃體出血，直腸呈彌漫性出血。

3實驗室檢測

3.1病原分離培養(yǎng)

從剖檢雞的心臟和肝臟采樣，無菌劃線接種于營養(yǎng)瓊脂。經(jīng)37℃恒溫培養(yǎng)24h，在瓊脂上可見有表面光滑、略微隆起的白色圓形的中等大小的菌落。挑取單個菌落接種于S.S瓊脂、麥康凱瓊脂、伊紅美藍(lán)瓊脂和三糖鐵斜面穿刺。置于37℃恒溫培養(yǎng)24h。結(jié)果如圖1、2、3、4。

由圖1、2、3、4結(jié)果可見，在S.S瓊脂上僅有少量的紅色的菌落，麥康凱瓊脂上形成紅色菌落，伊紅美藍(lán)瓊脂上形成黑色帶金屬光澤的菌落，三糖鐵斜面產(chǎn)氣變色。

3.2病原鏡檢

挑取單個菌落固定于載玻片上，經(jīng)革蘭氏染色，鏡檢觀察。結(jié)果如圖5，可見分離菌為紅色的短小桿菌。

3.3生化鑒定

將純培養(yǎng)的病原菌進(jìn)行生化鑒定，結(jié)果可見分離菌能夠分解甘露醇、蔗糖、乳糖、麥芽糖、木糖、鼠李糖等，能夠分解葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，山梨醇產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。吲哚試驗、M.R.試驗、精氨酸脫羧酶、賴氨酸均為陽性，硫化氫、尿素酶、V-P試驗、枸櫞酸鹽、硝酸鹽還原等均為陰性，從而可以判定分離菌為大腸桿菌。

3.4藥敏實驗

試驗采用K-B試紙擴(kuò)散法，使用滅菌后的棉簽蘸取純培養(yǎng)的大腸桿菌菌液，均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂平板，使用灼燒后的鑷子取藥敏紙片貼于瓊脂表面，紙片相互間隔在24mm。37℃培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。以標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株ATCC25922作參照。結(jié)果判定參照CLSI手冊。本次選用26種常見藥物進(jìn)行試驗，結(jié)果見表1。

由表1可知，大腸桿菌分離株對粘桿菌素、磷霉素中敏，慶大霉素、氧氟沙星、阿米卡星高敏，其他藥物均不敏感。

3.5 PCR鑒定

從發(fā)病雞的肺臟、肝臟、脾臟等器官各取樣1g，剪碎混勻后取0.05g研磨，加入1mL生理鹽水繼續(xù)研磨混勻后，8，000rpm離心后取上清進(jìn)行RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，使用北京世紀(jì)元亨公司生產(chǎn)的新城疫病毒通用型RT-PCR檢測試劑盒。使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果，結(jié)果如圖6。

由圖6結(jié)果可見，能夠在樣品中擴(kuò)增出特異性大小的條帶，與陽性對照一致。

4診斷

根據(jù)病雞的臨床癥狀、病理剖檢以及實驗室檢測結(jié)果，病雞可以診斷為新城疫繼發(fā)大腸桿菌病。5治療

針對臨床分離到的病原和藥敏實驗結(jié)果，雞群使用新城疫IV系疫苗4倍量飲水緊急免疫。使用高敏感藥物慶大霉素拌水治療大腸桿菌感染，同時對已發(fā)病的病雞予以淘汰并無害化處理。養(yǎng)殖場提高飼養(yǎng)管理水平，加強(qiáng)清掃和消毒工作。經(jīng)過5d的治療，未有新發(fā)生和死亡病雞，雞群恢復(fù)正常。

6討論

隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，養(yǎng)殖場對新城疫的免疫越來越重視，尤其是在大規(guī)模現(xiàn)代化的養(yǎng)殖場，新城疫免疫較好。但是散養(yǎng)戶和一些小規(guī)模的養(yǎng)殖場還存在免疫不到位的情況，導(dǎo)致新城疫不斷地發(fā)生。病毒也在不斷地變異中，出現(xiàn)強(qiáng)毒株和超強(qiáng)毒株，基因VII型強(qiáng)毒株也逐漸成為當(dāng)前新城疫流行的主要基因型，嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展。經(jīng)過與養(yǎng)殖場管理人員的溝通，得知本例雞場屬于農(nóng)村傳統(tǒng)養(yǎng)殖模式下的半散養(yǎng)狀態(tài)，未免疫過任何疫苗，飼養(yǎng)管理水平低下，缺乏科學(xué)的養(yǎng)殖理念，導(dǎo)致此次新城疫感染。

大腸桿菌作為養(yǎng)殖業(yè)常見的一種致病菌，能夠引起人和多種動物的感染和發(fā)病。尤其是在病毒感染后很容易繼發(fā)感染，增加了雞的發(fā)病率和死亡率。針對大腸桿菌，養(yǎng)殖場通常是定期在飼料中添加一些抗菌藥物進(jìn)行預(yù)防和治療，在使用過程中不進(jìn)行輪換用藥，這是導(dǎo)致大腸桿菌耐藥性的一個重要原因。由于不斷出現(xiàn)耐藥菌株，就需要在臨床防治疾病過程中進(jìn)行藥敏試驗，本例雞場在發(fā)病后并未進(jìn)行藥敏試驗，而自主購買了氟苯尼考進(jìn)行治療，沒有效果，這與實驗室檢測中藥敏試驗結(jié)果相同。