趙 紅 姚平波

(南華大學(xué)護(hù)理學(xué)院，衡陽421001)

成纖維細(xì)胞增生在肺纖維化形成過程中扮演著重要的角色。目前認(rèn)為：基質(zhì)金屬蛋白酶(ADAMTS-1)、血管緊張素1-7(Ang1-7)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)等信號(hào)通路能夠誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞凋亡介導(dǎo)成纖維細(xì)胞增生[1-3]。如何有效減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)肺纖維化細(xì)胞的凋亡、拮抗肺成纖維化細(xì)胞的增殖，目前仍然是肺纖維化靶向藥物研究的熱點(diǎn)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)：H2S能介導(dǎo)PD-1/PD-L1信號(hào)通路對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠肺纖維化具有潛在內(nèi)源性的保護(hù)作用[4]；同時(shí)，本課題組研究還發(fā)現(xiàn)：miR-21在小鼠肺成纖維化細(xì)胞模型中可介導(dǎo)ADAMTS-1/TGF-β1信號(hào)通路促肺纖維化[5]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1誘導(dǎo)肺纖維化可介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress，ERS)，過度ERS可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡介導(dǎo)肺纖維化的病理生理過程[6]。Beermann等[6,7]研究發(fā)現(xiàn)：通過調(diào)控lncRNA的表達(dá)，亦可減少ERS介導(dǎo)的小鼠肺成纖維化細(xì)胞凋亡及增殖，從而起到保護(hù)肺細(xì)胞的作用。因此，本研究通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察H2S是否能夠抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)肺纖維化的細(xì)胞凋亡？假如是，是否H2S調(diào)控miR-21表達(dá)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激起到保護(hù)肺纖維化的作用？

1 材料與方法

1.1主要試劑與藥品 DMEM培養(yǎng)液(Sigma-Aldrich)；胎牛血清(20%FBS，Gibco)；化學(xué)修飾的miR-21 agomir、miR-21 antagomir、蛋白提取試劑盒、CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(廣州市銳博生物科技有限公司)；NaHS(美國Sigma)；TGF-β1、GRP78、caspase-12、CHOP及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)等抗體(Santa Cruz,USA)。

1.2方法

1.2.1成纖維化細(xì)胞培養(yǎng) NIH3T3(購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心)，其培養(yǎng)內(nèi)容詳細(xì)見本課題組前期的報(bào)道[1]。

1.2.2分組 對(duì)照組：不加入TGF-β1，普通細(xì)胞培養(yǎng)箱(37℃，5%CO2及95%空氣)孵育24 h；TGF-β1組：NIH3T3加入TGF-β1(5 μg/L)培養(yǎng)24 h；NaHS干預(yù)組：NIH3T3加入TGF-β1(5 μg/L)培養(yǎng)24 h前1 h給予NaHS(40 μmol/L)預(yù)處理。為進(jìn)一步觀察miR-21是否參與H2S抑制ERS介導(dǎo)的小鼠成纖維化細(xì)胞凋亡，將其分為如下3組：陰性對(duì)照組： 轉(zhuǎn)染miR-21陰性對(duì)照片段(50 μmol/L)24 h后，給予NaHS(40 μmol/L)預(yù)處理， 再行TGF-β1處理；miR-21 agomir組：轉(zhuǎn)染miR-21模擬劑(50 μmol/L)24 h后，NaHS(40 μmol/L)預(yù)處理，再行TGF-β1處理;miR-21 antagomir組：轉(zhuǎn)染 miR-21拮抗劑(50 μmol/L)24 h后， 給予NaHS(40 μmol/L)預(yù)處理，再行TGF-β1處理。miR-21陰性對(duì)照片段、miR-21 agomir及miR-21 antagomir轉(zhuǎn)染方法詳細(xì)見試劑盒說明書操作。

1.2.3凋亡及增殖的檢測(cè) 流式細(xì)胞儀和CCK-8分別檢測(cè)NIH3T3細(xì)胞凋亡率及其增殖。

1.2.4Western blot 募集細(xì)胞后PBS洗滌3次，加入裂解液裂解懸浮細(xì)胞，然后置于冰上半小時(shí)后，將其在4℃下離心(10 000 r/min，10 min)，提取上清液，用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，隨后電泳(SDS-PAGE)，采用硝酸纖維素(PVDF)電轉(zhuǎn)膜；5%脫脂牛奶封閉1 h后，加入一抗(miR-21、GRP78、CHOP、caspase-12及β-actin)，4℃12 h TBST洗膜20 min加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h TBST洗膜10 min，然后用化學(xué)發(fā)光法顯色，采集圖像(UVP 型凝膠圖像分析系統(tǒng))，分析條帶積分吸光度(Imag J 軟件)。計(jì)算目的蛋白(miR-21、GRP78、CHOP及caspase-12)相對(duì)量。

1.2.5qRT-PCR 提取其RNA(TRIzol法)，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，然后行PCR循環(huán)取RT-PCR產(chǎn)物電泳(1.2%瓊脂糖凝膠)，miR-21、GRP78、caspase-12及CHOP等加樣后溴化乙錠染色，電泳條帶采用UVP型凝膠圖像分析系統(tǒng)做積分吸光度測(cè)定和分析。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物10 μl，在熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行PCR循環(huán)反應(yīng)，經(jīng)溶解曲線分析PCR反應(yīng)產(chǎn)物為單獨(dú)的雙鏈DNA。采用ΔΔCt值法， 以GAPDH為內(nèi)參定量miR-21、GRP78、caspase-12及CHOP mRNA表達(dá)?；蛞镄蛄杏缮虾Ｉ锕こ逃邢薰竞铣?。引物序列見表1。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件包，計(jì)量資料兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)比較采用F檢驗(yàn)或單因素方差分析，計(jì)量資料采用卡方檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1NaHS對(duì)細(xì)胞凋亡率、增殖率、miR-21蛋白和mRNA的影響 與對(duì)照組比較，TGF-β1組細(xì)胞凋亡率、增殖率、miR-21蛋白和mRNA均明顯升高(P<0.01)；與TGF-β1組比較，NaHS干預(yù)組細(xì)胞凋亡率、增殖率、miR-21蛋白和mRNA均明顯降低(P<0.05)。見表2。

表1熒光實(shí)時(shí)定量PCR所用引物序列

Tab.1Primersequencesusedbyreal-timefluorescencequantitativePCR

GenesPrimer sequences(5′→3′)Amplificationproducts(bp)miR-21ACACTCCAGCTGGGTAGCTTATCAGACTGA85TGGTGTCGTGGAGTCGCHOPGGGAAACAGCGCATGAAGGA176GCGTGATGGTGCTGGGTACAGRP78ACGTCCAACCCGGAGAACA193TTCCAAGTGCGTCCGATGAcaspase-12CACTGCTGATACAGATGAGG124CCACTCTTGCCTACCTTCCGAPDHGTCGGTGTGAACGGATTTG181TCCCATTCTCAGCCTTGAC

GroupsThe rate of cell apoptosisThe rate of cell proliferationmiR-21 ProteinsmRNAControl5.64±1.2212.48±1.231.14±0.071.00±0.05TGF-β124.31±2.791)27.89±1.661)4.12±0.231)3.15±0.131)NaHS6.72±1.902)13.28±1.412)1.36±0.112)1.17±0.092)

Note:1)P<0.01 vs control； 2)P<0.05，3)P<0.01 vs TGF-β1.

GroupsThe expression of proteinGRP78caspase-12CHOPThe expression of mRNAGRP78caspase-12CHOPControl1.00±0.111.00±0.131.00±0.191.00±0.101.00±0.121.00±0.14TGF-β12.58±0.431)1.85±0.511)3.11±0.291)2.46±0.301)1.79±0.111)2.79±0.201)NaHS1.33±0.143)1.31±0.112)1.58±0.153)1.35±0.113)1.18±0.103)1.23±0.123)

Note:1)P<0.01 vs control；2)P<0.05，3)P<0.01 vs TGF-β1 .

GroupsThe expression of proteinGRP78caspase-12CHOPThe expression of mRNAGRP78caspase-12CHOPNegative control1.00±0.111.00±0.131.00±0.191.00±0.101.00±0.121.00±0.14miR-21 agomir3.55±0.401)2.65±0.331)4.00±0.491)3.42±0.341)2.29±0.201)3.69±0.341)miR-21 antagomir1.03±0.142)0.97±0.082)1.18±0.112)1.05±0.102)0.98±0.092)0.99±0.072)

Note:1)P<0.01 vs control；2)P<0.01 vs TGF-β1 .

圖1 Western blot檢測(cè)不同組NIH3T3細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白表達(dá)Fig.1 Detection the expression of proteins of ERS in NIH3T3 cells of different groups by Western blot method

圖2 Western blot檢測(cè)miR-21對(duì)NIH3T3細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Detection the effect of miR-21 on expression of proteins of ERS in NIH3T3 cells by Western blot method

2.2內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子的蛋白和mRNA表達(dá)的比較 與對(duì)照組比較，TGF-β1組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子GRP78、caspase-12及CHOP蛋白和mRNA均明顯升高(P<0.01)；與TGF-β1組比較，NaHS干預(yù)組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子GRP78、caspase-12及CHOP蛋白和mRNA均明顯降低(P<0.05)。見表3及圖1。

2.3miR-21對(duì)NIH3T3細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白和mRNA表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，miR-21 agomir組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子GRP78、caspase-12及CHOP蛋白和mRNA均明顯升高(P<0.01)；與miR-21 agomir組比較，miR-21 antagomir組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子GRP78、caspase-12及CHOP蛋白和mRNA均明顯降低(P<0.05)。見表4及圖2。

3 討論

本課題組前期研究還證實(shí)：外源性H2S介導(dǎo)TGF-β1/Smad信號(hào)通路下調(diào)α-SMA及抑制ColⅠ、ColⅢ合成從而起到抗肺纖維化作用[8]。近年來證據(jù)表明：H2S可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬信號(hào)通路介導(dǎo)凋亡相關(guān)酶的去泛素化修飾或磷酸化修飾來調(diào)控ERS的穩(wěn)態(tài)，起到改善糖尿病大鼠心肌纖維化的作用[9]。因此，本研究進(jìn)一步探討H2S是否調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激穩(wěn)態(tài)，減輕細(xì)胞凋亡抑制肺纖維化；是否與miR-21的調(diào)控密切相關(guān)將是本研究的新視角。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是重要的細(xì)胞器之一，許多疾病的發(fā)生發(fā)展都與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能穩(wěn)態(tài)息息相關(guān)。大量研究表明：內(nèi)環(huán)境失衡，如缺血/再灌注損傷、炎癥介質(zhì)爆炸性釋放、氧化應(yīng)激、細(xì)胞自由基失衡、Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡等可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[10]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可啟動(dòng)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路(標(biāo)志物如caspase-12)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白反應(yīng)(標(biāo)志物如GRP78、CHOP)和炎性信號(hào)通路[11-13]。研究也證實(shí)：適度的ERS可通過磷酸化或去泛素化修飾未折疊/錯(cuò)誤折疊蛋白，恢復(fù)機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，維持細(xì)胞的正常生命活動(dòng)，一旦有害的ERS持續(xù)進(jìn)行可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[11-14]。因此，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能是參與肺纖維化發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵的病理生理機(jī)制之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)：GRP78、CHOP與caspase-12表達(dá)趨勢(shì)反映了ERS凋亡信號(hào)通路的細(xì)胞活性。

本研究結(jié)果提示：NaHS預(yù)處理體外培養(yǎng)的小鼠成纖維化細(xì)胞，可顯著減少TGF-β1誘導(dǎo)NIH3T3細(xì)胞肺纖維化過程中的細(xì)胞凋亡率及增殖率。證實(shí)了外源性H2S對(duì)TGF-β1損傷的小鼠成纖維化細(xì)胞具有內(nèi)源性保護(hù)作用；同時(shí)還證實(shí)：外源性H2S可減少TGF-β1損傷的小鼠成纖維化細(xì)胞GRP78、CHOP與caspase-12的表達(dá)，表明外源性H2S可減少TGF-β1誘導(dǎo)的ERS性細(xì)胞凋亡。另外，外源性H2S可降低TGF-β1損傷的小鼠成纖維化細(xì)胞miR-21的表達(dá)水平，更進(jìn)一步證實(shí)miR-21可誘導(dǎo)ERS激活細(xì)胞凋亡信號(hào)通路促肺纖維化。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)：miR-21可在轉(zhuǎn)錄后水平特異性靶向甄別靶點(diǎn)基因如ADAMTS-1等因子，以不同的修飾方式抑制或加速降解靶點(diǎn)基因而發(fā)揮促纖維化的作用[5]。Sun等[2]研究表明：miR-21調(diào)控JNK/AP-1/STAT1/STAT3信號(hào)通路介導(dǎo)凋亡因子caspase-12的激活，也可調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制加重臟器的損傷，故調(diào)控miR-21的表達(dá)可減輕上述病理生理過程[15,16]。鑒于miR-21廣泛參與生物學(xué)效應(yīng)及調(diào)控肺臟的生理病理過程的事實(shí)。因此，我們推測(cè)miR-21可能參與了外源性H2S抑制ERS介導(dǎo)NIH3T3細(xì)胞凋亡的調(diào)控。

為此，我們對(duì)小鼠肺成纖維化細(xì)胞的miR-21基因的表達(dá)予以調(diào)控。研究表明：miR-21高表達(dá)的miR-21 agomir組GRP78、CHOP與caspase-12的表達(dá)均明顯上調(diào)，提示上調(diào)miR-21增加ERS介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性細(xì)胞凋亡， 高表達(dá)miR-21降低H2S的保護(hù)性作用。而miR-21 antagomir組GRP78、CHOP與caspase-12的表達(dá)均明顯下調(diào)，提示下調(diào)miR-21可減少ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，低表達(dá)miR-21增加H2S的肺細(xì)胞保護(hù)作用。上述研究結(jié)果提示：miR-21參與了H2S保護(hù)損傷的肺成纖維化細(xì)胞。本研究從miR-21轉(zhuǎn)錄后調(diào)控這一新視角揭示H2S精準(zhǔn)調(diào)控ERS凋亡相關(guān)基因的可能信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，這將為臨床上的靶向藥物研發(fā)提供新的證據(jù)。但H2S如何調(diào)控miR-21的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)ERS凋亡的機(jī)制及信號(hào)通路尚須更進(jìn)一步深入的研究。