何俊金 王建萍 丁雪梅 曾秋鳳 白世平 張克英

(四川農業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所，動物抗病營養(yǎng)教育部重點實驗室，動物抗病營養(yǎng)與飼料農業(yè)部重點實驗室，成都 611130)

我國是世界上最大的雞蛋生產和消費國，雞蛋產量約占全世界總產量的45%，且呈逐年上升的趨勢。目前高產蛋雞產蛋后期45周齡時產蛋率降到88%左右，而后產蛋率下降速度逐漸增快，80周齡時下降到60%左右。同時，長期高產蛋積累的應激導致雞蛋品質下降，包括蛋殼質量和蛋清品質，因而如何提高雞蛋品質特別是產蛋后期的雞蛋品質至關重要。前人研究報道也證實氧化應激造成的繁殖性能衰退可能是蛋雞產蛋后期和應激時產蛋性能下降的主要原因[1]。

茶多酚(tea polyphenols,TP)是茶葉中多酚類物質的總稱，主要為兒茶素類(占60%～80%)，是茶葉中有保健功能的主要成分之一。茶多酚具有較強的抗氧化能力，研究表明其抗氧化能力是維生素C的25倍，是維生素E的80倍[2-3]。茶多酚具有抑菌、抗病、改善腸道微生物環(huán)境和降血脂等作用，可保障動物機體健康，但對蛋雞生產性能的影響并不一致[4]。同時，有研究報道，茶多酚能夠一定程度上改善雞蛋品質，降低雞蛋中的膽固醇含量[4]。樓洪興等[5]等研究發(fā)現(xiàn)，在蛋雞飼糧中添加250、550和1 000 mg/kg茶多酚(純度為40%)對蛋雞產蛋率有一定的改善作用，但隨著茶多酚的添加水平的提高未見有增高趨勢，添加400 mg/kg茶多酚降低46周齡蛋雞血清總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白含量并提高高密度脂蛋白含量；張旭等[6]在蛋雞飼糧中添加100 mg/kg茶多酚(純度為98%)能夠顯著提高平均蛋重，顯著降低料蛋比和蛋黃膽固醇含量；Biswas等[7]發(fā)現(xiàn)，飼糧添加300 mg/kg的綠茶粉使蛋雞采食量顯著下降，平均蛋重顯著降低。由此可見，茶多酚對蛋雞生產性能和蛋品質影響的報道并不一致，這可能與茶多酚添加物的純度和添加劑量不同有關。目前茶多酚對蛋雞脂質代謝影響的研究較少，有待進一步的揭示。因此，本試驗通過考察高劑量茶多酚對產蛋后期蛋雞生產性能、蛋品質和脂質代謝的影響，探討提高產蛋后期蛋雞產蛋性能和蛋品質的營養(yǎng)手段。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用茶多酚產品由四川克魯尼茶葉生物科技有限公司提供，其純度為63.58%，其中兒茶素含量為40.20%，表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)含量為21.97%，咖啡堿含量為6.84%。

1.2 試驗動物與飼糧

試驗選用65周齡的健康羅曼粉殼蛋雞480羽，采用單因素完全隨機設計，將蛋雞分為4組，每組8個重復，每個重復15羽。預試期2周，正試期9周。

試驗用基礎飼糧為玉米-豆粕型飼糧，在四川農業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所試驗基地參照我國《雞飼養(yǎng)標準》(NY/T 33—2004)中蛋雞營養(yǎng)成分推薦值配制?；A飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

1)維生素預混料為每千克飼糧提供 Vitamin premix provided the following per kilogram of the diet:VA 8 000 IU，VD31 600 IU，VE 5 IU，VB10.8 mg，VB22.5 mg，VB61.5 mg，VB120.004 mg，D-泛酸D-pantothenic acid 2.2 mg，葉酸 folic acid 0.25 mg，煙酸 nicotinic acid 20 mg，生物素 biotin 0.1 mg。2)礦物質預混料為每千克飼糧提供 Mineral premix provided the following per kilogram of the diet:Mn(MnO2) 60 mg，Zn(ZnSO4·7H2O) 80 mg，Cu(CuSO4·5H2O) 8 mg，F(xiàn)e(FeSO4·7H2O) 60 mg，I(KI) 0.35 mg，Se(Na2SeO3·5H2O) 0.3 mg。3)代謝能為計算值，其他為測定值。ME was a calculated value, while the others were measured values.

1.3 試驗設計與飼養(yǎng)管理

將4組蛋雞隨機分為1個對照組和3個試驗組，對照組蛋雞飼喂基礎飼糧，試驗組蛋雞分別飼喂在基礎飼糧中添加666、1 333和2 666 mg/kg茶多酚的試驗飼糧。

飼養(yǎng)試驗在四川農業(yè)大學動物營養(yǎng)所試驗場進行。所有試驗蛋雞均采用3層階梯式籠養(yǎng)，每籠3只雞，連續(xù)的5籠為1個重復，每組8個重復。全程采用粉料飼養(yǎng)，光照16 h，舍內溫度控制在22 ℃左右，自由飲水，每天喂食2次(09:00和15:00)，并觀察雞只有無異常行為，每天16:00揀蛋并記錄稱重。定期打掃圈舍衛(wèi)生，并按常規(guī)程序進行雞只免疫和圈舍消毒。

1.4 測定指標與方法

1.4.1 生產性能指標的測定

產蛋率、平均蛋重：正試期內每日以重復為單位記錄產蛋數(shù)和產蛋重，計算產蛋率和平均蛋重。

平均日采食量：每天記錄飼糧的添給與損耗情況，每周結算飼糧總采食量，計算平均日采食量。

料蛋比：根據(jù)產蛋總重和總采食量計算料蛋比。

1.4.2 蛋品質指標的測定

在試驗第9周結束時每個重復采集2枚外形完好、重量接近平均蛋重的雞蛋(16：00采集，19:00測定蛋品質)，采用蛋品質全自動測定儀(EMT-7300，日本)對蛋殼強度、蛋黃顏色和哈夫單位進行測定。小心移除蛋清后，對蛋黃重和蛋殼重進行稱量，計算蛋殼比率、蛋黃比率和蛋白比率。

蛋殼比率(%)=100×蛋殼重/蛋重； 蛋黃比率(%)=100×蛋黃重/蛋重； 蛋白比率(%)=100×(蛋重-蛋黃重-蛋殼重)/蛋重。

蛋黃膽固醇含量：使用高效液相色譜法測定蛋黃膽固醇含量，具體方法參照GB/T 22220—2008。

蛋黃脂肪酸組成：使用氣相色譜法測定蛋黃脂肪酸組成，具體方法參照NY/T 2068—2011。

1.4.3 血清脂質代謝指標的測定

在試驗第9周結束時，每個重復隨機挑選1只健康的蛋雞，從翅靜脈抽取10 mL血液，分離血清，-20 ℃保存，采用全自動生化分析儀(HITACHI7020，日本)測定血清甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量。

1.4.4 肝臟脂質代謝相關基因mRNA相對表達量的測定

將采集血液后的蛋雞頸靜脈放血屠宰，分離肝臟左葉尖端1.5 g左右，裝于2 mL滅菌EP管中，立即保存于液氮中，然后置于-80 ℃冰箱保存，用于測定肝臟脂質代謝相關基因mRNA的相對表達量。

根據(jù)NCBI公布的脂肪酸合成酶(FAS)、低密度脂蛋白受體(LDLR)、極低密度脂蛋白受體(VLDLR)、腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)和β-肌動蛋白(β-actin)的基因序列來設計引物并檢測引物的特異性，以β-actin作為內參基因。引物由Invitrogen公司合成，目的基因和內參基因的引物序列見表2。

肝臟組織中RNA的提取采用兩步法按說明書操作。使用SYBR?Premix Ex TaqTMKit(TaKaRa生物有限公司，日本)試劑盒進行熒光定量PCR測定。采用Applied Biosystems 7900HT Real Time PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems，CA)進行PCR擴增反應，程序如下：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán)；熔解曲線條件：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。參考Livak等[8]的方法，以β-actin為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA的相對表達量，以相對于對照組的變化倍數(shù)表示。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并采用Duncan氏法進行組間多重比較，P≤0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 飼糧中添加高劑量茶多酚對蛋雞生產性能的影響

由表3可知，與對照組相比，2 666 mg/kg茶多酚組第1～3周、第4～6周和第1～9周產蛋率均顯著下降(P<0.05)。與對照組相比，各茶多酚添加組的平均日采食量呈不同程度的降低，但隨著試驗進行，各茶多酚添加組的平均日采食量逐漸上升，與對照組的差距逐漸縮小，2 666 mg/kg茶多酚組的平均日采食量在第1～3周、第4～6周、第7～9周和第1～9周均顯著低于對照組(P<0.05)，1 333 mg/kg茶多酚組的平均日采食量在第1～3周和第4～6周顯著低于對照組(P<0.05)且顯著高于2 666 mg/kg茶多酚組(P<0.05)，666 mg/kg茶多酚組的平均日采食量在第1～3周顯著低于對照組(P<0.05)且顯著高于2 666 mg/kg茶多酚組(P<0.05)。2 666 mg/kg茶多酚組的平均蛋重在第1～3周和第1～9周顯著低于對照組與666 mg/kg茶多酚組(P<0.05)，1 333和2666 mg/kg茶多酚組的平均蛋重在第4～6周顯著低于對照組(P<0.05)。2 666 mg/kg茶多酚組的料蛋比在第1～3周和第4～6顯著高于其他各組(P<0.05)。

表2 引物序列

表3 飼糧中添加高劑量茶多酚對蛋雞生產性能的影響

同行數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P≤0.05)，無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P≤0.05), while with the same letter or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.2 飼糧中添加高劑量茶多酚對蛋雞蛋品質的影響

由表4可知，與對照組相比，飼糧中添加不同劑量的茶多酚對蛋殼強度、蛋黃顏色、蛋黃比率和蛋白比率均無顯著影響(P>0.05)。2 666 mg/kg茶多酚組哈夫單位在第2周顯著高于對照組(P<0.05)，1 333 mg/kg茶多酚組哈夫單位在第4周顯著高于其他各組(P<0.05)。2 666 mg/kg茶多酚組蛋殼比率在第2周顯著低于對照組與1 333 mg/kg茶多酚組(P<0.05)，且1 333 mg/kg茶多酚組蛋殼比率在第2周也顯著低于對照組(P<0.05)。

表4 飼糧中添加高劑量茶多酚對蛋雞蛋品質的影響

2.3 飼糧中添加高劑量茶多酚對蛋雞蛋黃膽固醇含量和脂肪酸組成的影響

由表5可知，與對照組相比，飼糧中添加不同劑量的茶多酚顯著影響蛋黃膽固醇含量(P<0.05)，且隨著茶多酚添加劑量的增加，蛋黃膽固醇含量有降低趨勢。666、1 333和2666 mg/kg茶多酚組蛋黃膽固醇含量顯著低于對照組(P<0.05)，且2 666 mg/kg茶多酚組蛋黃膽固醇含量還顯著低于666 mg/kg茶多酚組(P<0.05)。飼糧中添加不同劑量的茶多酚對蛋黃脂肪酸組成無顯著影響(P>0.05)。

表5 飼糧中添加高劑量茶多酚對蛋雞蛋黃膽固醇含量和脂肪酸組成的影響

2.4 飼糧中添加高劑量茶多酚對蛋雞血清脂質代謝指標的影響

由表6可知，與對照組相比，飼糧中添加不同劑量的茶多酚對蛋雞血清高密度脂蛋白膽固醇含量無顯著影響(P>0.05)。與對照組相比，666、1 333和2 666 mg/kg茶多酚組血清總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇含量顯著降低(P<0.05)，1 333和2 666 mg/kg茶多酚組血清甘油三酯含量顯著降低(P<0.05)。

表6 飼糧中添加高劑量茶多酚對蛋雞血清脂質代謝指標的影響

2.5 飼糧中添加高劑量茶多酚對蛋雞肝臟脂質代謝相關基因表達的影響

由圖1可知，666、1 333和2 666 mg/kg茶多酚組肝臟AMPKmRNA相對表達量顯著高于對照組(P<0.05)，且2 666 mg/kg茶多酚組肝臟AMPKmRNA相對表達量還顯著高于666和1 333 mg/kg茶多酚組(P<0.05)。肝臟脂質代謝其他相關基因(FAS、LDLR和VLDR)mRNA的相對表達量各組間均差異不顯著(P>0.05)。

3 討 論

3.1 飼糧中添加高劑量茶多酚對蛋雞生產性能的影響

通過對蛋雞進行9周的茶多酚飼喂試驗，結果表明，飼糧添加666 mg/kg茶多酚對蛋雞產蛋率沒有顯著影響，而添加2 666 mg/kg茶多酚后蛋雞的產蛋率顯著下降。這可能與本試驗發(fā)現(xiàn)的添加茶多酚以后降低了蛋雞的采食量有關。這與前人研究結果并不相同，樓洪興等[5]在飼糧中添加250、550和666 mg/kg茶多酚(純度為40%)后發(fā)現(xiàn)對蛋雞的產蛋率有一定改善作用，但隨著茶多酚的添加劑量的提高未見有增高趨勢。樓洪興等[5]的試驗結果與本試驗結果不同的原因可能是茶多酚的來源和添加劑量的不同，本試驗添加的茶多酚產品中含有一部分咖啡堿(6.84%)，而咖啡堿可能與蛋雞采食量的降低有關，且本試驗中茶多酚的添加劑量遠遠高于樓洪興等[5]的試驗。

數(shù)據(jù)柱標注不同小寫字母表示差異顯著(P≤0.05)，不標注字母或標注相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。

本試驗中，飼糧中添加不同劑量的茶多酚均可降低蛋雞的平均蛋重，這與相關報道相近，例如，飼糧中添加0.67%茶葉提取物略微降低平均蛋重[9]，飼糧中添加5%和10%綠茶粉顯著降低蛋重[10]。除采食量降低是影響蛋重的原因外，兒茶素抑制了腸道對脂肪的吸收和脂肪酶活性，使蛋黃脂質形成受阻[9-10]，也會影響蛋重。

本試驗中，各茶多酚添加組料蛋比均高于對照組，與前人研究結果不相同。王人悅[11]試驗表明茶多酚顯著降低料蛋比；汪小紅等[12]研究發(fā)現(xiàn)，400 mg/kg茶多酚顯著降低了試驗期前4周的平均蛋重，200 mg/kg茶多酚顯著降低了試驗期后4周的料蛋比。上述研究結果與本試驗結果不同的原因可能是茶多酚的來源和添加劑量的不同。

飼糧中添加不同劑量的茶多酚后蛋雞平均日采食量均下降，產蛋率和平均蛋重下降及料蛋比的升高均與采食量下降有極大關系。據(jù)尹靖東等[13]報道，飼喂蛋雞綠茶粉時，隨著綠茶粉添加劑量的增加，蛋雞的采食量也增加，這與本試驗結果不相同。Biswas等[7]報道，飼糧中添加0.3%的綠茶粉(飼糧中茶多酚含量約為600 mg/kg)可使蛋雞的采食量顯著下降，本試驗結果與之相似。造成結果不同的原因可能有：蛋雞對茶多酚本身或咖啡堿的苦澀味并不適應，蛋雞對茶多酚有一個逐漸的適應過程，在試驗初期蛋雞采食量急劇下降，之后逐漸增加；另外，茶多酚中含有的酚酸、咖啡堿及縮合單寧等抗營養(yǎng)因子[14]，破壞或阻礙蛋雞對營養(yǎng)物質的消化吸收，造成蛋白質消化率下降，產生食欲不振[15]等癥狀。

3.2 飼糧中添加高劑量茶多酚對蛋雞蛋品質的影響

在試驗第2周，2 666 mg/kg茶多酚組蛋殼比率顯著低于對照組，這可能與本試驗使用的茶多酚產品中含有部分咖啡堿(6.84%)有關。有前人研究表明，咖啡堿的攝入會導致鈣的流失和骨質疏松等不良反應，可明顯遏制鈣在消化道中的吸收，使體內缺鈣，從而影響蛋殼質量，造成蛋殼比率下降[16-17]。

飼糧中添加茶多酚能夠增加雞蛋的哈夫單位，哈夫單位能夠反映蛋的新鮮程度[18]。影響雞蛋哈夫單位的因素有貯存時間和溫度以及蛋雞年齡、應激、營養(yǎng)、營養(yǎng)素的補充、疾病等[19-20]，在環(huán)境和條件相同的情況下，營養(yǎng)是影響雞蛋哈夫單位的關鍵因素。自由基會對蛋白質造成損傷，導致蛋白質變性或功能喪失[21]，而茶多酚具有很強的清除自由基能力，飼糧中添加茶多酚增加雞蛋的哈夫單位的主要原因可能就與其具有抗氧化功能有關。

兒茶素可能會抑制腸道脂肪的吸收和脂肪合酶的活性，從而造成蛋黃脂質形成受阻[22]。本試驗發(fā)現(xiàn)茶多酚對蛋黃比率無顯著影響，可以推測添加茶多酚后蛋重降低并不是因為茶多酚抑制腸道脂肪的吸收和脂肪酶的活性引起的，更可能是因為茶多酚中的抗營養(yǎng)因子影響了蛋雞的生產性能。

本試驗中，飼糧中添加茶多酚能夠降低蛋黃中膽固醇的含量，與齊廣海等[23]報道的隨著飼糧中茶多酚添加劑量的增加，蛋黃膽固醇含量逐漸下降的趨勢一致。雞蛋中膽固醇大部分來自母雞肝臟合成的脂蛋白，主要是極低密度脂蛋白(VLDL)，其次是卵黃蛋白原，蛋雞肝臟和卵巢是膽固醇生物合成的主要場所，肝臟可以高速度合成膽固醇，并且能夠快速將膽固醇以脂蛋白形式運送到血液，血液中的膽固醇大部分隨VLDL轉入蛋黃，以產蛋的形式排出[24]。

3.3 飼糧中添加高劑量茶多酚對蛋雞血清脂質代謝指標的影響

本試驗中，飼糧中添加不同劑量的茶多酚均降低了蛋雞血清總膽固醇、甘油三酯與低密度脂蛋白膽固醇含量，這與樓洪興等[5]得出的在飼糧中添加0.4%茶多酚可降低46周齡蛋雞血清膽固醇、甘油三酯與低密度脂蛋白膽固醇含量的結果相似。隨著茶多酚添加劑量的增加，血清甘油三酯含量有降低趨勢，說明脂肪分解增強。茶多酚降血脂作用機制可能與雌激素有關，茶多酚可通過調節(jié)雌激素、削弱雌激素維持高血脂的作用，表現(xiàn)出降血脂作用；此外，茶多酚能夠通過抑制體內生脂酶活性和基因表達，從而抑制肝臟中脂類的合成。

3.4 飼糧中添加高劑量茶多酚對肝臟脂質代謝相關基因表達的影響

肝臟在家禽的脂質代謝中起著重要的作用，是脂肪酸從頭合成的主要部位[25]，占脂肪酸合成量的90%以上。動物體內脂肪組織合成與分解的調控比較復雜，主要是由脂質代謝關鍵酶來完成，酶蛋白的多寡和活性的高低是由關鍵酶基因的表達量來決定的。AMPK是維持體內能量平衡的關鍵物質[26]。AMPK被活化的同時使機體代謝方向朝著抑制耗能的合成代謝、促進產能的分解代謝方向進行。AMPK被活化后，可以在許多組織中對脂質代謝進行調節(jié)。在肝臟組織中，AMPK可以促進脂肪酸氧化，降低膽固醇、甘油三酯的合成，抑制脂肪酸的產生。本試驗發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，飼糧中添加666、1 333和2 666 mg/kg茶多酚均可以顯著升高肝臟AMPKmRNA的相對表達量，對其他肝臟脂質代謝相關基因mRNA的相對表達量無顯著影響。近幾年的大量研究表明，AMPK基因被激活后，可以降低動物細胞及機體中脂肪酸及膽固醇的合成[27]。AMPK可以抑制固醇調節(jié)元件序列，固醇調節(jié)元件結合蛋白通過結合固醇調節(jié)元件來起到轉錄激活LDLR基因的表達，從而加快膽固醇的合成與代謝。AMPK在動物試驗上取得了相當多的研究成果，為降低雞蛋中膽固醇的含量提供了新的思路。根據(jù)AMPK在脂質代謝中起到的重要作用，推測茶多酚可能通過調控AMPK基因的表達進而影響蛋雞膽固醇的代謝。

4 結 論

① 飼糧中添加高劑量(1 333和2 666 mg/kg)茶多酚會降低蛋雞的生產性能，但可提高雞蛋的哈夫單位，降低蛋黃膽固醇含量以及血清總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇和甘油三酯含量。

② 飼糧中添加高劑量(1 333和2 666 mg/kg)茶多酚上調了蛋雞肝臟AMPK基因的表達，對肝臟其他脂質代謝相關基因的表達沒有產生顯著影響。