張 輝，白 晨，王華忠，張惠忠，李曉東，付增娟， 趙尚敏，鄂圓圓，張自強(qiáng)，王 良，張必周

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 甜菜研究所，黑龍江 哈爾濱 150080；2.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031)

甜菜是重要的糖料作物，分布在東北、華北和西北三大片區(qū)。近年來(lái)甜菜種植面積逐漸增加，農(nóng)民種植甜菜的經(jīng)濟(jì)效益也有所增加，但伴隨甜菜種植面積的擴(kuò)大，病害也有所加重。甜菜叢根病(BNYVV)是甜菜生產(chǎn)中的重要病害，能導(dǎo)致甜菜的嚴(yán)重減產(chǎn)和含糖率的降低，對(duì)農(nóng)民和制糖企業(yè)都造成嚴(yán)重?fù)p失。防治叢根病的有效手段是栽種抗病品種，甜菜是2年生作物，育種周期較長(zhǎng)，育種程序繁瑣，繁育一個(gè)綜合性狀良好的抗病品種至少需要8-10年。近年來(lái)分子輔助育種發(fā)展迅速，分子標(biāo)記、基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)、基因工程日趨發(fā)展成熟，為育種家們提供了新的研究思路。將分子方法與常規(guī)育種結(jié)合起來(lái)能有效地加快育種進(jìn)程，縮短育種年限，提高育種效率。

蛋白組學(xué)是從蛋白質(zhì)角度入手，研究基因組所表達(dá)的全套蛋白質(zhì)。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)體系的不斷發(fā)展、不斷完善，各種植物蛋白質(zhì)組學(xué)快速發(fā)展。甜菜作為重要的糖料作物，近年來(lái)其蛋白組學(xué)也有所發(fā)展。國(guó)外甜菜蛋白組學(xué)研究主要在芽勢(shì)變化[1]、重金屬脅迫[2]、抗旱性[3]、抗鹽性[4]、育性[5]等方面有報(bào)道。國(guó)內(nèi)相關(guān)學(xué)者也主要從育性、抗旱、產(chǎn)質(zhì)量等方面進(jìn)行了研究，其中曹洪祥[6]報(bào)道了對(duì)甜菜M14品系花器官進(jìn)行特異性表達(dá)蛋白質(zhì)的研究；牛佳[7]對(duì)甜菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系與保持系花期差異蛋白表達(dá)開(kāi)展了研究；李國(guó)龍等[8]開(kāi)展了對(duì)甜菜葉片應(yīng)答干旱脅迫處理進(jìn)行的差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析；王雪峰[9]對(duì)甜菜塊根膨大過(guò)程的蛋白組變化也進(jìn)行了相關(guān)研究。此外，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)對(duì)BNYVV侵染系統(tǒng)寄主煙草和大果甜菜的生物學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)特點(diǎn)進(jìn)行比較分析研究[10]。目前，關(guān)于甜菜蛋白質(zhì)組學(xué)的報(bào)道相對(duì)于其他作物還是相對(duì)較少，特別是糖用甜菜與叢根病病原互作的蛋白水平變化研究尚未見(jiàn)正式報(bào)道，因此，本研究針對(duì)甜菜叢根病抗性開(kāi)展一系列研究，對(duì)加快甜菜抗叢根病品種的培育工作有著重要的理論和實(shí)踐意義。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料：抗病材料為病1(HB-1)、病2(N122)，感病材料為病5(HX-5)、病6(I-1)，均為內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院甜菜研究所自育材料，其中病1和病5為同一品系中選擇的抗、感病材料，病2和病6為同一品系中選擇的抗、感病材料，對(duì)照材料(CK)為KWS1197。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

盆栽試驗(yàn)：在自然條件下進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，病土為病圃地內(nèi)二級(jí)病土，致病性極強(qiáng)，無(wú)病土取自4年以上非重茬的無(wú)病害健康土地。于2016年6月20日播種，實(shí)施地點(diǎn)為內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院特色作物研究所。

水培試驗(yàn)：將盆栽長(zhǎng)至第1片真葉展開(kāi)后(苗齡15 d)的部分甜菜幼苗進(jìn)行水培移栽，每天光照12 h，溫度24 ℃，水培營(yíng)養(yǎng)液用Hogland營(yíng)養(yǎng)液。對(duì)水培材料用病土水進(jìn)行澆灌，同時(shí)用傷根方法進(jìn)行侵染。叢根病病毒檢測(cè)取樣部位為水培材料苗根部，總蛋白提取取樣部位為苗葉片。實(shí)施地點(diǎn)為內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院特色作物研究所光照組培室。

田間試驗(yàn)：實(shí)施地點(diǎn)設(shè)在內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院叢根病病圃地，大田試驗(yàn)小區(qū)按照隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，小區(qū)行長(zhǎng)5 m，小區(qū)寬1.1 m，行距55 cm，株距18 cm。每個(gè)材料播種2行，3個(gè)重復(fù)。于2016年5月4日播種，10月5日收獲，進(jìn)行測(cè)產(chǎn)檢糖，8月20日進(jìn)行田間發(fā)病調(diào)查，調(diào)查方法參照甜菜種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 叢根病病毒浸染檢測(cè) RNA提取與純化使用天根試劑盒，提取后樣品溶于DEPC水中，-70 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?，分光光度?jì)在OD260和OD280條件下測(cè)定RNA含量和純度。RT-PCR檢測(cè)BNYVV[11]，擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物利用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。叢根病病毒檢測(cè)所用正向引物序列為(5′-TTACCAGGTCCACGAAAG-3′)，反向引物序列為(5′-TGTTGAGGTCGGTGCTGA-3′)。

1.3.2 總蛋白提取 總蛋白提取采用TCA/丙酮沉淀法[12]、可溶性蛋白提取法[13]和酚提取法[14]3種方法。

1.3.3 蛋白質(zhì)濃度檢測(cè) 以水培材料病2為試驗(yàn)對(duì)象，脅迫處理前取樣。檢測(cè)方法：①?gòu)臐饪s后的蛋白干粉中取15 mg，向其中加入150 μL的蛋白裂解液復(fù)融；②濃縮后的蛋白干粉很難溶解，可通過(guò)反

表1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線所加試劑劑量Tab.1 The dosage needed for drawing standard curve

復(fù)凍融的方法促進(jìn)蛋白溶解，直到看不見(jiàn)蛋白顆粒為止；③從上清液中取1 μL，稀釋100倍，用于測(cè)定蛋白含量；④采用Bradford法[15]定量蛋白質(zhì)，取6支試管，編號(hào)后，按表1加入試劑。

1.3.4 雙向電泳及凝膠染色 第一向等電聚焦采用水化上樣的方法；第二向SDS-PAGE凝膠電泳采用12% SDS-PAGE凝膠垂直板電泳；凝膠染色采用經(jīng)典考馬斯亮藍(lán)染色。表2為17 cm固相IPG膠條第一向等電聚焦設(shè)置的電泳程序。每個(gè)樣品3次重復(fù)，用Image Master 2D Platinum Trial 5.0軟件對(duì)凝膠進(jìn)行檢測(cè)及匹配分析。

表2 17 cm固相IPG膠條第一向等電聚焦程序Tab.2 The first isoelectric focusing procedure of 17 cm solid phase IPG adhesive strip

1.3.5 LC-MS/MS(液質(zhì)聯(lián)用)分析 蛋白質(zhì)膠內(nèi)酶解：①清洗脫色：考染膠用1 mL脫色液(50% 乙腈+25 mmol/L碳酸氫銨溶液)清洗多次，直至膠點(diǎn)脫色；②清洗后的膠點(diǎn)，加入500 μL乙腈脫水；③56 ℃條件下使用10 mmol/L DTT(二硫蘇糖醇)處理膠點(diǎn)1 h，還原打開(kāi)二硫鍵；④在暗室使用55 mmol/L IAM(碘乙酰胺)處理膠點(diǎn)45 min，進(jìn)行半胱氨酸的烷基化封閉；⑤用1 μg/μL的胰蛋白酶溶液覆蓋膠點(diǎn)；⑥冰上放置30 min后，補(bǔ)加25 mmol/L碳酸氫銨溶液至覆蓋膠點(diǎn)，37 ℃消化過(guò)夜；⑦轉(zhuǎn)移膠點(diǎn)外面存留的液體；⑧用50%乙腈從膠點(diǎn)中萃取肽段1次，再用100%乙腈萃取1次；⑨2次萃取的溶液和第7步的溶液合并，冷凍抽干。

LC-MS/MS上機(jī)：①將抽干后的肽段干粉離心；②用LC流動(dòng)相的水相溶解干粉，振蕩離心后取上清液上機(jī)；③LC設(shè)置：島津LC-20AB泵，安捷倫ZORBAX SB_C18色譜柱，流速0.3 mL/min；④MS設(shè)置：LTQ OrbitrapVelos質(zhì)譜，HESI源，正離子掃描模式，分辨率60 000，裂解方式CID。

蛋白質(zhì)膠點(diǎn)鑒定主要是通過(guò)試驗(yàn)產(chǎn)生的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，與數(shù)據(jù)庫(kù)模擬得到的理論質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行匹配，從而得到蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果。數(shù)據(jù)庫(kù)的選擇主要包括NCBI和TheBetavulgarisResource數(shù)據(jù)庫(kù)，蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析由華大基因完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間性狀調(diào)查比較

2.1.1 苗期長(zhǎng)勢(shì) 對(duì)盆栽試驗(yàn)材料進(jìn)行對(duì)比可知，在苗期抗病材料的病土和健康土上存在著較大差異(圖1)，生長(zhǎng)勢(shì)在病土要低于健康土，干物質(zhì)含量在病土也要低于健康土，感病材料表現(xiàn)相同。

圖1 甜菜盆栽材料在苗期病土和非病土長(zhǎng)勢(shì)情況Fig.1 Growth status of beet materials on diseased soil and non-diseased soil at seedling stage

2.1.2 發(fā)病情況 對(duì)病圃中甜菜生長(zhǎng)后期發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查，如圖2所示，抗病材料發(fā)病情況明顯低于感病材料。感病材料葉片萎蔫、葉脈變黃。圖3為抗病材料和感病材料的正常植株與發(fā)病植株的葉片比較圖，抗病材料表現(xiàn)良好，發(fā)病較輕。

圖2 叢根病病圃地材料生長(zhǎng)后期田間長(zhǎng)勢(shì)Fig.2 The field growth of materials on clump root disease nursery in late growth stage

2.1.3 產(chǎn)量與含糖測(cè)定 對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行測(cè)產(chǎn)、檢糖。試驗(yàn)數(shù)據(jù)如表3所示，對(duì)叢根病具有抗性的材料病1、病2每公頃產(chǎn)糖量均極顯著高于對(duì)照，較對(duì)照分別提高8.50%和20.26%。每公頃塊根產(chǎn)量病1略低于對(duì)照，病2高于對(duì)照4.47%，病2較病1表現(xiàn)更好。感病材料病5、病6每公頃塊根產(chǎn)量和產(chǎn)糖量均極顯著低于對(duì)照，每公頃塊根產(chǎn)量分別較對(duì)照低27.48%和33.44%，每公頃產(chǎn)糖量較對(duì)照低32.47%和37.24%。感病材料較抗病材料田間性狀表現(xiàn)明顯較差。

注:不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著。

Note:Different capital letters mean extremely significant difference.

2.2 叢根病毒檢測(cè)

以盆栽結(jié)合水培的模式對(duì)叢根病抗病材料與感病材料進(jìn)行病毒侵染處理，并利用RT-PCR檢測(cè)BNYVV病毒(圖4)。以甜菜無(wú)菌組培植株作為陰性對(duì)照，以甜菜病圃發(fā)病植株作為陽(yáng)性對(duì)照，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄PCR凝膠電泳顯示，病毒脅迫處理前后，與陽(yáng)性對(duì)照相比較，侵染材料均出現(xiàn)特異性條帶，并且隨著侵染時(shí)期的延長(zhǎng)病毒濃度增加，證實(shí)病土水澆灌處理后，試驗(yàn)材料被侵染，含有甜菜黃脈壞死病毒。

A. 不同試驗(yàn)材料RNA檢測(cè)，1～4分別代表病1、病2、病5、病6；B～D. 脅迫前、脅迫25 d、脅迫35 d后BNYVV病毒檢測(cè)， 1～6分別代表病1、病2、發(fā)病植株、無(wú)菌組培苗、病5和病6。 A. RNA detection of Different materials，lane 1-4 respectively represent the disease 1，2，5，6； B-D. Detection of BNYVV before stress， after 25 and 35 days of stress，lane 1-6 respectively represent disease 1，2，diseased plants，sterile plantlets，disease 5 and 6.

2.3 蛋白質(zhì)提取方法比較及濃度檢測(cè)

采用3種總蛋白提取方法進(jìn)行垂直聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)(圖5)，在上樣量均為15 μL的情況下，TCA/丙酮法提取條帶最清晰，效果最好。酚提取法較之顏色稍淺，可溶性蛋白提取法條帶最淺。Bradford法定量蛋白質(zhì)，試驗(yàn)測(cè)得提取的蛋白質(zhì)檢測(cè)吸光值為0.848，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖6)比對(duì)，蛋白質(zhì)濃度約為75.50 mg/L，符合雙向電泳要求。

圖5 三種蛋白提取方法的聚丙烯酰胺凝膠電泳比較Fig.5 Comparison of three protein extraction methods by according to polyacrylamide gel electrophoresis

圖6 Bradford法定量所做的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 The standard curve drawing by Bradford method

2.4 蛋白質(zhì)膠點(diǎn)檢測(cè)及LC-MS/MS(液質(zhì)聯(lián)用)分析

雙向電泳后利用Image Master 2D Platinum Trial 5.0對(duì)病1、病5以及病2、病6進(jìn)行蛋白質(zhì)膠點(diǎn)檢測(cè)及匹配分析(表5)，其中病1共檢測(cè)到338個(gè)蛋白點(diǎn)，病5檢測(cè)到284個(gè)蛋白點(diǎn)，病2檢測(cè)到314個(gè)蛋白點(diǎn)，病6檢測(cè)到285個(gè)蛋白點(diǎn)。雙向電泳每個(gè)樣品重復(fù)3次，通過(guò)匹配分析及投射光觀察扣除差異蛋白點(diǎn)共計(jì)78個(gè)。其中病2扣除蛋白點(diǎn)40個(gè)，病1扣除21個(gè)，病5扣除14個(gè)，病6扣除3個(gè)。

表5 試驗(yàn)材料蛋白質(zhì)膠點(diǎn)檢測(cè)Tab.5 Detection of material protein glue point

將扣除的具有明顯差異的蛋白點(diǎn)78個(gè)送華大基因進(jìn)行蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析。病2和病6之間檢測(cè)到的蛋白質(zhì)中28個(gè)樣品為肽段支持?jǐn)?shù)大于等于1的顯著性結(jié)果，其中23個(gè)樣品為肽段支持?jǐn)?shù)大于等于2的顯著性結(jié)果；病1和病5之間檢測(cè)到的蛋白質(zhì)中34個(gè)樣品為肽段支持?jǐn)?shù)大于等于1的顯著性結(jié)果，其中24個(gè)樣品為肽段支持?jǐn)?shù)大于等于2的顯著性結(jié)果。最終選肽段支持?jǐn)?shù)大于2(拋除重復(fù)的)的顯著性結(jié)果，總共鑒定有效蛋白質(zhì)ID為34個(gè)。表6為部分甜菜差異蛋白點(diǎn)MALDI-TOF-TOF/MS鑒定結(jié)果。

對(duì)有效蛋白ID通過(guò)NCBI和TheBetavulgarisResource數(shù)據(jù)庫(kù)Blast比對(duì)。這些蛋白質(zhì)序列均能和TheBetavulgarisResource數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列比對(duì)上，NCBI比對(duì)能檢測(cè)到大部分同源序列。比對(duì)結(jié)果顯示相關(guān)差異蛋白主要是光合作用、糖代謝、呼吸抗氧化作用、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、脂代謝及一些未知蛋白質(zhì)。其中光合作用蛋白包括景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶、葉綠素a/b結(jié)合蛋白、光系統(tǒng)Ⅱ相關(guān)蛋白、葉綠體的莖環(huán)結(jié)合蛋白，糖代謝相關(guān)蛋白包括內(nèi)切β-甘露糖苷酶、5-核糖-磷酸異構(gòu)酶、果糖二磷酸醛縮酶、腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，呼吸作用蛋白包括氧增強(qiáng)蛋白、核酮糖二磷酸羧化/加氧酶活化酶，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白包括葉綠體未知AARF域包含蛋白激酶at1g79600、絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶、核孔復(fù)合體蛋白、腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，脂代謝蛋白包括可溶性無(wú)機(jī)焦磷酸酶、半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶。病1和病2主要表達(dá)的功能蛋白以光合作用、糖代謝、呼吸抗氧化作用、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、脂代謝及一些未知蛋白質(zhì)為主，而病5和病6主要表達(dá)光合作用蛋白和呼吸抗氧化蛋白，即自身應(yīng)激反應(yīng)所表達(dá)的蛋白質(zhì)。

表6 部分甜菜差異蛋白點(diǎn)MALDI-TOF-TOF/MS鑒定結(jié)果Tab.6 MALDI-TOF-TOF/MS identification of the differential protein spots of sugar beet

表6(續(xù))

3 結(jié)論與討論

甜菜叢根病抗性一直以來(lái)都是甜菜育種工作者研究的重點(diǎn)內(nèi)容，我國(guó)20世紀(jì)90年代末篩選出對(duì)叢根病具有抗性的育種材料，但對(duì)于其抗性機(jī)理并沒(méi)有研究透徹。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)相關(guān)研究人員對(duì)叢根病病毒的類(lèi)型進(jìn)行了研究[10，16]。國(guó)內(nèi)其他關(guān)于叢根病相關(guān)的報(bào)道也大多是從病毒及抗性酶方面進(jìn)行研究。本研究首次針對(duì)內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院自育的抗/感病材料，對(duì)具有叢根病抗性的材料進(jìn)行田間表型鑒定，驗(yàn)證了育種材料中含有叢根病抗性資源，為育種工作者選育叢根病抗性材料提供了相應(yīng)的理論依據(jù)。

蛋白組學(xué)是近年發(fā)展起來(lái)的研究方法，近年來(lái)在其他植物上發(fā)展迅速，如水稻[17]、大豆[18]、小麥[19]、油菜[20]、甘蔗[21]、木薯[22]等。本研究對(duì)甜菜叢根病病毒侵染后的抗病感病材料在蛋白質(zhì)水平進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn)抗性材料較感病材料檢測(cè)到的蛋白質(zhì)點(diǎn)更多一些，說(shuō)明有一些特異性蛋白質(zhì)表達(dá)，其中有些蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)。說(shuō)明抗病材料在抗病機(jī)理上與感病材料有所不同。質(zhì)譜分析后通過(guò)NCBI和和TheBetavulgarisResource數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast比對(duì)，這些蛋白質(zhì)序列均能和TheBetavulgarisResource數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列比對(duì)上。這些表達(dá)的功能蛋白以光合作用、糖代謝、呼吸抗氧化作用、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、脂代謝及一些未知蛋白質(zhì)為主。這與植物對(duì)逆境的應(yīng)激生理反應(yīng)是基本一致的。在甜菜與BNYVV互作的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)了許多光合作用和能量相關(guān)蛋白的表達(dá)，包括核糖二磷酸酶、葉綠素a/b結(jié)合蛋白、光系統(tǒng)反應(yīng)中心亞基、ATP酶等。植物在逆境期間對(duì)能量資源的管理通常是為了提供防御所需的能量，并且在某些兼容的病毒/宿主相互作用中，預(yù)測(cè)到參與光合作用的蛋白質(zhì)很可能被病毒本身激活，從而產(chǎn)生病毒復(fù)制所需的代謝能量[23]。植物的初級(jí)代謝包括所有對(duì)植物的生存、生長(zhǎng)和發(fā)育至關(guān)重要的代謝途徑。相比之下，次級(jí)代謝產(chǎn)物是在其他代謝途徑中產(chǎn)生的化合物，盡管這些代謝途徑很重要，但對(duì)植物的功能并不重要；然而，這些蛋白質(zhì)中的許多在植物防御中是重要的。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是在單個(gè)細(xì)胞內(nèi)部和整個(gè)植物內(nèi)傳遞信息的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在細(xì)胞水平上一旦受到生物或非生物脅迫，就會(huì)被激活，從而導(dǎo)致植物的許多途徑和細(xì)胞過(guò)程發(fā)生變化。在BNYVV感染過(guò)程中，有幾種蛋白被表達(dá)，這些蛋白被預(yù)測(cè)與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。鈣調(diào)素是一種被廣泛研究的蛋白質(zhì)，在植物細(xì)胞信號(hào)傳遞和調(diào)控許多目標(biāo)蛋白方面發(fā)揮著重要作用[24]。已鑒定的幾種感興趣的蛋白質(zhì)，之前據(jù)報(bào)道它們與植物的防御反應(yīng)或植物對(duì)其他刺激的反應(yīng)有關(guān)，主要包括：內(nèi)切酶、葡萄糖苷酶、過(guò)氧化物酶。這些可能與植物對(duì)病毒的敏感性有關(guān)。