徐晉珩 劉麗云 鄢麗敏 張志勇 夏慶安 王正暉

(唐山市工人醫(yī)院病理科，河北 唐山 063000)

目前人類結(jié)腸癌的患病率日益增長(zhǎng)的趨勢(shì)已得到廣泛共識(shí)，并且研究表明它在腫瘤世界范圍內(nèi)的排行為第三位〔1〕，據(jù)我國(guó)學(xué)者統(tǒng)計(jì)，在國(guó)內(nèi)發(fā)病率較高的前五類腫瘤，其中就有結(jié)直腸癌〔2〕。隨著人類對(duì)自身機(jī)體是否處于良好狀態(tài)的要求有所提高，因此對(duì)于腫瘤的剖析也需要提高到一定層次。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)的特點(diǎn)是：長(zhǎng)度由200個(gè)以上的核苷酸組成〔3〕，并且它的開放式閱讀框是不完整且沒有特異性的，是一種極少有蛋白編碼功能的非編碼RNA〔4〕。有學(xué)者提出〔5〕，lncRNA的異常表達(dá)在腫瘤發(fā)生及癌癥相關(guān)性方面能夠誘導(dǎo)或加速其病理改變病情進(jìn)展。近年更有研究表明lncRNA在基因表達(dá)過程中是關(guān)鍵調(diào)控分子，相關(guān)靶基因的表達(dá)調(diào)控在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后等多種水平有重要體現(xiàn)。結(jié)腸癌的研究進(jìn)展中，一些文獻(xiàn)報(bào)道了有關(guān)不同類型的lncRNA表達(dá)異常時(shí)發(fā)揮的作用，如促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖〔6～8〕、遷移〔9，10〕和侵襲能力〔11，12〕，抑制癌細(xì)胞凋亡及在細(xì)胞周期方面的影響力〔13〕。隨著人類對(duì)腫瘤學(xué)的認(rèn)知不斷深入，lncRNA的種類被更多的發(fā)現(xiàn)，有學(xué)者得出在一些腫瘤類型中，差異性表達(dá)存在于腫瘤組織與其相鄰的正常組織間的結(jié)論〔14〕。lncRNA尿路上皮癌胚抗原(UCA)1在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中有一定的作用，表明它有一定的致癌作用，對(duì)結(jié)直腸癌而言說明了UCA1對(duì)其細(xì)胞周期的作用為負(fù)調(diào)節(jié)，與細(xì)胞凋亡呈負(fù)相關(guān)〔15，16〕?；诮鼛啄甑难芯?，有報(bào)道稱發(fā)現(xiàn)了與結(jié)腸癌發(fā)病有密切關(guān)聯(lián)的因素，這個(gè)重要角色的扮演者就是微衛(wèi)星不穩(wěn)定性，研究還表明結(jié)腸癌患者發(fā)病起到關(guān)鍵作用的正是微衛(wèi)星不穩(wěn)定的癌細(xì)胞〔17～19〕。本研究旨在檢測(cè)lncRNA UCA1在微衛(wèi)星不穩(wěn)定的結(jié)腸癌細(xì)胞中的水平，進(jìn)而分析其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1時(shí)間及地點(diǎn) 實(shí)驗(yàn)于2015年12月至2016年5月在河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2主要材料及來源 人結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo系、正常結(jié)腸細(xì)胞HUM-CELL-0033(均由河北醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞研究中心提供)10%胎牛血清(上?？ㄅ锟萍加邢薰?、磷酸鹽緩沖液(PBS)、RT-PCR 試劑盒(TaKaRa公司)；LipofectamineTM 2000(Invitrogen公司)、siRNA(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；無血清RPMI1640培養(yǎng)液、Transwell(武漢博士德生物有限公司)；兔抗人MSH2與MSH6單克隆抗體(Cell Signaling Technology公司)，RIPA裂解液、5×十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)蛋白上樣緩沖液及聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白檢測(cè)試劑盒(均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司)、尼龍膜(美國(guó)Pall公司)。

1.3方法

1.3.1檢測(cè)人正常結(jié)腸細(xì)胞HUM-CELL-0033及微衛(wèi)星不穩(wěn)定的人類結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo細(xì)胞系中UCA1的水平 細(xì)胞的復(fù)蘇培養(yǎng)：從冰箱中取出儲(chǔ)存在凍存管中凍存的HUM-CELL-0033及LoVo細(xì)胞，將凍存管放置在37 ℃的水箱中進(jìn)行水浴，使兩種細(xì)胞進(jìn)行快速融化復(fù)蘇，經(jīng)過1 min HUM-CELL-0033及LoVo細(xì)胞已完全融化，1 min后取出凍存管，向其中加入α-MEM培養(yǎng)基，將其放置在特定條件的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃含有5%CO2，邊培養(yǎng)邊觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。PCR檢測(cè)：細(xì)胞經(jīng)Trizol法獲得總RNA，然后經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，應(yīng)用引物(UCA1的上游引物為5′-GGAGCTGTTGAGCCTTCAGT-3′，下游引物為5′-ATTGAGAGCACAGTGGGGTG-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，ABI7300檢測(cè)同時(shí)分析各組細(xì)胞的UCA1水平。 PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.3.2基因轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染開始的前1 d，把LoVo接種于6孔板上，這樣就會(huì)保證待轉(zhuǎn)染細(xì)胞在1 d之內(nèi)混濁度變?yōu)?0%～50%，然后依據(jù)LipofectamineTM 2000的說明書上的步驟開始實(shí)驗(yàn)操作，在250 μl的Opti-MEN低血清培養(yǎng)基(無血清)中稀釋siRNA，慢慢搖晃至均勻，然后同樣將LipofectamineTM 2000在另外的250 μl Opti-MEN培養(yǎng)基中輕搖至勻，待雙方都靜置(室溫)5 min后混合在一起(注意：要在30 min內(nèi)混合LipofectamineTM 2000和siRNA的稀釋液)，搖勻，再次靜置20 min，接著下一步將混合物滴入到6孔板內(nèi)，輕搖，使混合物與孔內(nèi)的液體盡可能混勻。然后將其放入培養(yǎng)箱內(nèi)，室溫，5%CO2，待培養(yǎng)2～3 d后，接著進(jìn)行轉(zhuǎn)染之后的實(shí)驗(yàn)。siRNA的序列為：UCA1-siRNA正義鏈5′-GAGCCGAUCAGACAAACAATT-3′，反義鏈5′-UUGUUUGUCUGAUCGGCUCTT-3′；UCA1-siRNA2；陰性對(duì)照正義鏈5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT3′，反義鏈5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。參照物GAPDH引物序列上游：5′-TCCTCTGACTTCAACAGCGACAC-3′；下游5′-TCTCTCTTCCTCTTGTGCTCTTGC-3′。實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組、空載質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染UCA1 siRNA組

1.3.3Transwell小室檢測(cè)下調(diào)表達(dá)UCA1對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響 將以上轉(zhuǎn)染完成2 d之后的每個(gè)小組，應(yīng)用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)試劑盒分析UCA1對(duì)細(xì)胞侵襲力的變更，每個(gè)組分別設(shè)立3個(gè)復(fù)孔。采用胰酶分別消化每個(gè)組，然后PBS洗滌1～2次，接著調(diào)整細(xì)胞的密度(重懸)，在6孔板中按照每孔以1×105個(gè)把各組細(xì)胞置于Transwell上層的小室中，將無血清RPMI1640培養(yǎng)液(其內(nèi)含基質(zhì)凝膠)滴入小室內(nèi)，然后再將適量培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)滴入到底層小室其內(nèi)。培養(yǎng)箱的溫度為37℃，CO2濃度為5%，培育1 d。待培育結(jié)束時(shí)，棄掉孔內(nèi)的液體，同時(shí)PBS沖洗拿出來的小室，用棉棒小心的拂拭沒有遷移的細(xì)胞，然后以多聚甲醛固定0.5 h，并用0.04%結(jié)晶紫與之染色，倒置顯微鏡下記錄穿膜細(xì)胞的數(shù)目，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組任意抓拍8個(gè)視野，記錄其平均數(shù)值。此實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4劃痕實(shí)驗(yàn)觀察下調(diào)表達(dá)UCA1對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響 將所用器械進(jìn)行滅菌。先選取Marker筆在6孔板后標(biāo)注平行線(間距約1 cm)，橫孔穿過且每孔至少穿過5條平行線。將Lovo細(xì)胞置于孔中，每孔約5×105個(gè)，過夜。等到細(xì)胞密度約為50%時(shí)，依據(jù)上面的分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染到4～5 h時(shí)，換液，然后繼續(xù)進(jìn)行，直到2 d后細(xì)胞基本布滿時(shí)，將移液槍頭依著直尺，做到槍頭盡可能與6孔板反面的橫線垂直劃痕，千萬(wàn)不可以劃歪。然后將細(xì)胞用PBS洗滌3次，棄除劃掉的細(xì)胞，更換培養(yǎng)基(不含有血清)。然后將其放進(jìn)孵育箱(37℃，5%CO2)，培養(yǎng)。將劃痕處起始點(diǎn)標(biāo)為時(shí)間0點(diǎn)，依照每6 h取樣，光學(xué)顯微鏡下拍照，然后測(cè)定劃痕距離。

1.3.5Western印跡檢測(cè)DNA錯(cuò)配修復(fù)蛋白MSH2與MSH6的變化 將各組細(xì)胞待其被胰酶消化后收集放置，然后將RIPA試劑(含有蛋白酶抑制劑)用于裂解收集好的細(xì)胞，并將其擱置在冰塊上裂解0.5 h，同時(shí)每隔10 min震蕩搖晃細(xì)胞1次。然后放進(jìn)離心機(jī)上，離心15 min(14 000 r/min，4℃)。用吸管將上清液吸出，通過使用BCA檢測(cè)法檢測(cè)此蛋白的濃度，使其水浴變性之后，將5倍SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液滴入其中，然后把蛋白裂解液(即含有相同量的蛋白)通過用PAGE分離，電改變至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，下一步使用PBS緩沖液(內(nèi)含5%脫脂牛乳)搖床密封60 min(37℃)，實(shí)驗(yàn)所使用的一抗：MSH2抗體，MSH6抗體(都為稀釋的1∶1 000的抗人抗體，且都是單克隆抗體)，過夜培育(4℃)，完畢后用PBS-Tween洗膜15 min(37℃)，洗3次；而二抗使用抗兔〔辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記，1∶5 000)〕，同樣的培育(60 min，37℃)洗膜(3次，15 min)。最后用加強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光液辨析其顯影。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0 軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1LoVo細(xì)胞系中UCA1的水平 在微衛(wèi)星不穩(wěn)定的結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo系中UCA1的表達(dá)量(1.29±0.11)，相比較正常結(jié)腸細(xì)胞HUM-CELL-0033明顯為高水平(0.84±0.10，P<0.05)，表明UCA1在結(jié)腸癌細(xì)胞呈現(xiàn)異常表達(dá)，即微衛(wèi)星不穩(wěn)定的人類結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo中UCA1的程度顯著大于人普通結(jié)腸細(xì)胞HUM-CELL-0033中的相對(duì)表達(dá)的量。

2.2下調(diào)表達(dá)UCA1后細(xì)胞的侵襲能力 轉(zhuǎn)染UCA1siRNA組〔(20.63±2.79)個(gè)/高倍鏡視野〕比對(duì)照組細(xì)胞的穿膜數(shù)明顯減少〔(43.23±4.76)個(gè)/高倍鏡視野，P<0.05〕，空載質(zhì)粒組穿膜細(xì)胞數(shù)〔(41.98±4.43)個(gè)/高倍鏡視野〕與對(duì)照組無差異(P>0.05)。見圖1。

圖1 下調(diào)表達(dá)UCA1后細(xì)胞侵襲能力的比較(×200)

2.3下調(diào)表達(dá)UCA1后細(xì)胞的遷移能力 劃痕愈合百分比：對(duì)照組為(73.68±7.32)%、空載質(zhì)粒組為(74.54±6.34)%、轉(zhuǎn)染UCA1siRNA組為(24.78±3.56)%。轉(zhuǎn)染UCA1siRNA后細(xì)胞劃痕兩側(cè)的間距較對(duì)照組明顯增大，劃痕的愈合速度有所減慢，表示細(xì)胞的遷移能力減弱，見圖2。

2.4MSH2與MSH6蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)染UCA1siRNA組中MSH2與MSH6的蛋白所顯現(xiàn)出的表達(dá)量明顯少于對(duì)照組，說明下調(diào)表達(dá)UCA1可明顯降低細(xì)胞中MSH2與MSH6的表達(dá)，見表1、圖3。

圖2 下調(diào)表達(dá)UCA1后細(xì)胞的遷移能力(×200)

表1 MSH2與MSH6蛋白表達(dá)

與對(duì)照組比較：1)P<0.05

圖3 MSH2與MSH6蛋白電泳表達(dá)

3 討 論

lncRNA是被定義為在真核基因轉(zhuǎn)錄后〔20～22〕，能夠產(chǎn)生多種缺少蛋白編碼能力的RNA，近年來lncRNA在多個(gè)系統(tǒng)的腫瘤都發(fā)現(xiàn)有異常表達(dá)〔23〕。雖然近些年來人們對(duì)lncRNA越來越關(guān)注，尤其是在腫瘤領(lǐng)域〔24〕的研究進(jìn)展也有不少突破，但是具體的作用機(jī)制仍然需要深層剖析〔25〕。人們通過實(shí)驗(yàn)及生物信息學(xué)分析證實(shí)UCA1屬于lncRNA，且發(fā)現(xiàn)并不在人正常組織中進(jìn)行表達(dá)〔26〕。關(guān)于UCA1的表達(dá)也已經(jīng)被證實(shí)異常存在于腎癌、黑色素瘤〔27〕及口腔癌〔28〕和膀胱癌〔29〕等多種腫瘤組織中。lncRNA UCA1與一些消化系統(tǒng)腫瘤間的相關(guān)性經(jīng)過不斷的實(shí)驗(yàn)研究，有關(guān)報(bào)道接踵而出。如于食管鱗狀細(xì)胞癌〔30〕而言，過表達(dá)的UCA1被證實(shí)能造成其預(yù)后不良。在胰腺癌的研究中也有學(xué)者〔31〕指出，若調(diào)高UCA1可使胰腺癌細(xì)胞系的PANC-1細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強(qiáng)。還有肝癌〔32〕和胃癌〔33〕UCA1的作用機(jī)制正在逐步被人們鉆研。

當(dāng)今社會(huì)人們生活條件日益變好，而因?qū)︼嬍辰Y(jié)構(gòu)的不重視造成因結(jié)腸癌死亡人數(shù)的逐年增多〔34～36〕，對(duì)于結(jié)腸癌的治療也比較局限，隨著基因研究的不斷強(qiáng)大，探討基因與癌癥之間的關(guān)聯(lián)也是現(xiàn)代學(xué)者的重任。本研究顯示在結(jié)腸癌細(xì)胞中UCA1水平確實(shí)存在異常，且出現(xiàn)水平較高狀態(tài)，結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲、遷移能力在下調(diào)UCA1后有所減弱。文獻(xiàn)〔37〕中提到，這兩種能力對(duì)于患者而言，在造成死亡人數(shù)數(shù)量巨大化方面，其影響程度毋庸置疑。由于有研究證實(shí)結(jié)腸癌的預(yù)后和臨床病理與DNA錯(cuò)配修復(fù)相關(guān)聯(lián)〔38，39〕，即為當(dāng)DNA在復(fù)制時(shí)出現(xiàn)了基因的配對(duì)錯(cuò)誤，然后通過一些蛋白進(jìn)行修復(fù)〔40〕。本文提示UCA1下調(diào)后，DNA錯(cuò)配修復(fù)蛋白MSH2與MSH6數(shù)量也明顯減少。

本文通過實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到在微衛(wèi)星不穩(wěn)定的結(jié)腸癌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA UCA1出現(xiàn)高水平狀態(tài)，驗(yàn)證了其對(duì)癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響，這種影響還可能與DNA錯(cuò)配修復(fù)蛋白MSH2、MSH6有關(guān)。