李 靜， 白 玉， 張 鵬， 丁 瑞， 趙學梅

(齊齊哈爾醫(yī)學院 1藥學院， 2臨床藥理教研室， 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

血管性癡呆(vascular dementia，VD)是指由于腦血管疾病所導致的腦實質(zhì)損傷而引起智能和認知功能障礙的臨床綜合癥[1]。VD是我國老年癡呆的第二大致病因素，僅次于阿爾茨海默病(Alzheimer disease, AD)，已成為損害中老年人健康和生活質(zhì)量的常見病、多發(fā)病。血管性癡呆可導致空間認知和學習記憶障礙。隨著我國人口老齡化的不斷發(fā)展及腦血管疾病(例如中風)發(fā)病率的逐年上升，血管性癡呆可能成為引起老年癡呆的首位原因。

脫氫表雄酮(dehydroepiandrosterone，DHEA)是主要由腎上腺合成和分泌的一種性激素的前體物質(zhì)。DHEA也可在神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細胞中從頭合成，它是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量最豐富、活性最強的一種神經(jīng)甾體激素。DHEA可以通過多種不同機制發(fā)揮神經(jīng)保護、神經(jīng)調(diào)節(jié)和神經(jīng)營養(yǎng)的作用，能夠延緩衰老，還能改善情緒。人體內(nèi)DHEA濃度于20歲左右達到峰值，然后逐年遞減，而DHEA濃度下降可能導致老年癡呆等老年病的發(fā)生。DHEA對老年癡呆疾病作用的研究多集中在對AD的研究。實驗研究表明，DHEA可以改善Aβ癡呆大鼠的學習記憶功能，DHEA濃度降低與AD的發(fā)病率和Aβ在腦內(nèi)的沉積量正相關[2]。但是目前尚未查閱到DHEA對血管性癡呆的認知及記憶能力影響的相關報道。本研究采用雙側頸總動脈結扎(bilateral common carotid artery occlusion,BCCAO)缺血再灌注的方法，制作小鼠血管性癡呆模型，通過Y迷宮和新物體辨別行為學觀察及Western blot法檢測小鼠海馬組織神經(jīng)元核抗原(neuronal nuclear antigen, NeuN)、突觸小泡蛋白(synaptophysin,SYP)和突觸后致密蛋白95(postsynaptic density protein-95, PSD-95)的含量，研究DHEA對血管性癡呆小鼠學習和記憶的作用，并探討其可能機制。

材 料 和 方 法

1 動物

健康昆明小鼠40只，雄雌各半，體重18～22 g，購自哈爾濱醫(yī)科大學，動物許可證號為SYXK(黑)2016-001。

2 實驗試劑

DHEA購自Sigma；抗PSD-95抗體、抗SYP抗體和抗NeuN抗體購自Proteintech；BCA蛋白濃度測定試劑盒和I抗、II抗去除液購自碧云天生物技術研究所； II抗購自北京中杉金橋生物技術公司。

3 主要方法

3.1動物分組 實驗開始前動物適應性喂養(yǎng)1周，采用BCCAO法構建小鼠VD模型。將小鼠隨機分為5組：假手術(sham)組、模型(BCCAO)組、DHEA低劑量組(DEHA-low,20 mg/kg)、DHEA中劑量組(DHEA-middle,40 mg/kg)和DHEA高劑量組(DHEA-high,60 mg/kg)，每組8只小鼠。

3.2動物模型建立 將小鼠用戊巴比妥鈉(15 mL/kg)腹腔注射麻醉，固定于鼠板，充分暴露頸部皮膚，常規(guī)消毒。除假手術組外，每只小鼠均進行雙側頸總動脈結扎15 min后再灌注。假手術組小鼠僅分離迷走神經(jīng)，不結扎頸總動脈[3]。

3.3給藥方法[4]DHEA用DMSO溶解后，再用植物油將其稀釋成終濃度為0.1%的DMSO。低、中、高劑量組小鼠在缺血再灌注后24 h給予DHEA一次性腹腔注射。假手術組和模型組小鼠腹腔注射等體積的植物油。

3.4Y迷宮實驗[5]小鼠Y迷宮實驗裝置由呈現(xiàn)Y字型的3個支臂組成，分別為A、B和C臂，每個支臂長40 cm,高12 cm,底部寬5 cm,頂部寬10 cm。實驗時將小鼠放入固定某臂的末端，容許其自由進出3個臂。在5 min內(nèi)，記錄小鼠進臂總次數(shù) N及進臂順序。小鼠連續(xù)進入3個不同的臂被定義為1次正確交替反應，記錄正確交替反應次數(shù)(number of alternation)，用自發(fā)交替反應率(alternation beha-vior)反映小鼠空間工作記憶能力。計算公式為alternation behavior=number of alternation/(N-2)。

3.5新物體辨別實驗[5]實驗裝置是一個正方形盒子(長45 cm，寬45 cm，高15 cm)。測試前2 d，將小鼠放入實驗場地中適應環(huán)境5 min，每次1只，每日2次。測試當日，將小鼠放入實驗場地內(nèi)允許其自由探索3 min，然后取出，再將2個相同的物體(A1、A2)分別放置于距場地邊緣15 cm處，2者間隔15 cm。將小鼠與兩物體等距離處面向壁放入場地中，分別記錄5 min內(nèi)探索兩物體的時間(tA1和tA2)。1 h后，將A2換成新物體B，將小鼠再次放入，分別記錄5 min內(nèi)探索兩物體的時間(tA1和tB)。24 h后，將物體B換成新物體C，將小鼠再次放入，分別記錄5 min內(nèi)探索兩物體的時間(tA1和tC)。分別計算對新物體的優(yōu)先指數(shù)及辨別系數(shù)。優(yōu)先指數(shù)計算公式為： preferential index (1 h)=tB/(tA1+tB)； preferential index (24 h)=tC/(tA1+tC)。辨別系數(shù)計算公式為：discrimination index (1 h)=(tB-tA1)/(tA1+tB)； discrimination index (24 h)=(tC-tA1)/(tA1+tC) 。

3.6Western blot檢測相關蛋白表達 將小鼠斷頭處死，置于冰盤中，暴露腦組織，用生理鹽水沖洗表面血跡，快速分離出海馬組織，-80 ℃保存。提取假手術組、模型組和DHEA中劑量組(行為學治療效果最為顯著)蛋白，蛋白定量后，加入上樣緩沖液，煮沸 5 min，分裝。用10%聚丙烯酰胺分離膠，4% 聚丙烯酰胺濃縮膠進行電泳，將蛋白質(zhì)從 SDS-PAGE 凝膠轉移至PVDF 膜上，5% 脫脂奶粉封閉，加 I 抗，4 ℃孵育過夜，加 II 抗，室溫孵育2 h，顯影。用IPP軟件分析目的蛋白條帶的積分吸光度(integral absorbance，IA)，計算目的蛋白的相對表達量。

4 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料測定值采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組之間比較用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學差異。

結 果

1 DHEA對癡呆小鼠Y迷宮實驗的影響

實驗顯示各組小鼠進臂總次數(shù)的差異無統(tǒng)計學顯著性，提示DHEA對動物大腦皮層無興奮性影響，見圖1A。與假手術組的小鼠相比，模型組小鼠自發(fā)交替反應率顯著降低(P<0.01)；DHEA治療組可以顯著提高小鼠自發(fā)交替反應率(P<0.05)，提示DHEA能夠顯著提高小鼠空間記憶能力，見圖1B。

Figure 1.Effects of DHEA on the number of arm entries (A) and alternation behavior (B) of the mice in Y-maze test. Mean±SD.n=8.##P<0.01vssham group;*P<0.05,**P<0.01vsBCCAO group.

圖1DHEA對Y迷宮實驗中小鼠進臂總次數(shù)和自發(fā)交替反應率的影響

2 DHEA對癡呆小鼠新物體辨別實驗影響

實驗結果顯示，模型組小鼠的優(yōu)先指數(shù)和辨別系數(shù)均顯著低于模型組小鼠(P<0.01);與模型組相比，DHEA組顯著提高小鼠在新物體辨別實驗中的優(yōu)先指數(shù)和辨別系數(shù)，提示DHEA組小鼠對新物體辨別的記憶能力要強于模型組小鼠(P<0.01),見表1。

表1 DHEA對小鼠探索新物體能力的影響

##P<0.01vssham group;*P<0.05,**P<0.01vsBCCAO group.

3 DHEA對血管性癡呆小鼠海馬組織NeuN、SYP和PSD-95蛋白表達的影響

Western blot結果顯示，與假手術組相比，模型組的NeuN、SYP和PSD-95蛋白表達顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，DHEA組的NeuN、SYP和PSD-95蛋白表達顯著升高(P<0.05)，提示DHEA能顯著減少缺血導致神經(jīng)元的死亡，提高海馬突觸相關蛋白的表達，說明DHEA可以減少神經(jīng)元的丟失，改善突觸的功能，見圖2。

Figure 2.Effects of DHEA on the protein expression of NeuN, PSD-95 and SYP in the hippocampus. Mean±SD.n=5.#P<0.05vssham group;*P<0.05vsBCCAO group.

圖2DHEA對海馬NeuN、PSD-95和SYP蛋白表達的作用

討 論

隨著我國老齡化速度的進一步加快，血管性癡呆已成為老年癡呆的第二大致病因素。血管性癡呆是發(fā)生在腦血管病基礎之上，以記憶、認知功能缺損為主，或伴有語言、視空間技能及人格或情感障礙的獲得性智能的損害。多數(shù)學者認為，血管性癡呆可導致空間作業(yè)和認知能力下降，表現(xiàn)出分辨的準確性降低，出現(xiàn)明顯的學習記憶障礙[6]。血管性癡呆已經(jīng)成為嚴重威脅人類健康甚至是生命的重要疾病之一，雖然廣受關注，但是目前國內(nèi)外尚無可以控制該病病程進展的理想藥物。

DHEA是一種可在神經(jīng)系統(tǒng)中獨立合成的神經(jīng)甾體物質(zhì)，它在腦組織的含量高于其它組織，且腦中DHEA含量不受血清DHEA含量影響。DHEA具有多種作用，可改善情緒、認知、記憶功能，具有防治神經(jīng)退行性疾病及精神疾病的前景。本實驗采用雙側頸總動脈結扎缺血再放開的方法，致小鼠全腦缺血再灌注損傷，構建小鼠血管性癡呆模型。通過行為學實驗及Western blot實驗考察DHEA對血管性癡呆小鼠學習和記憶能力的改善作用及可能機制。

行為學實驗的種類不同，其考查學習記憶的種類也不同。Y迷宮實驗考查動物的工作記憶能力，而新物體辨別實驗則考察動物的行為辨別及記憶能力。通過Y迷宮實驗研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠與假手術組相比，進臂錯誤次數(shù)顯著增加，DHEA能夠顯著減少血管性癡呆小鼠在Y迷宮實驗中的錯誤反應次數(shù)，顯著增加自發(fā)交替反應率。新物體辨別實驗研究發(fā)現(xiàn)，與假手術組相比，模型組小鼠的辨別系數(shù)和優(yōu)先指數(shù)顯著降低，DHEA顯著提高癡呆小鼠對新物體的辨別能力。以上結果均提示DHEA能夠改善血管癡呆模型小鼠的空間認知、行為辨別及記憶能力。

神經(jīng)元損傷與死亡[7]，突觸的改變[8]是血管性癡呆發(fā)病的重要機制。有研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注后，可引起海馬神經(jīng)元損傷及數(shù)量減少、殘存神經(jīng)元突觸結構被破壞，進而引起突觸功能障礙[9]。NeuN被稱為神經(jīng)細胞特異抗原的標志物，常作為檢測神經(jīng)元的指標。通過Western blot對小鼠海馬區(qū)NeuN蛋白的表達水平進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)與模型組相比，DHEA組小鼠NeuN的表達水平顯著增高。實驗結果提示DHEA具有減少海馬神經(jīng)元丟失的作用。

突觸是神經(jīng)元網(wǎng)絡聯(lián)系和信息傳遞者，是學習記憶形成的基礎，對代謝紊亂、能量缺乏高度敏感，腦缺血會造成突觸相關蛋白的丟失[10-11]。腦缺血-再灌注損傷導致的突觸傳遞障礙可能是導致血管性癡呆學習記憶障礙的重要機制之一。海馬是與學習記憶密切相關的部位，但同時也是最易受缺血因素影響的腦區(qū)之一。SYP是一種與突觸結構和功能相關的囊泡膜上的特異性鈣結合蛋白。SYP存在于突觸前的囊泡上，常把它作為突觸前的特異性標志物。SYP在突觸囊泡的導入、轉運和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放過程中均發(fā)揮重要作用，而且參與突觸囊泡的再循環(huán)和突觸發(fā)生。突觸素減少，說明突觸囊泡的轉運能力降低，傳遞性能下降[12]。研究發(fā)現(xiàn)，認知功能下降的抑郁癥小鼠其SYP在mRNA和蛋白水平表達下調(diào)，突觸重塑受到破壞[13]。PSD-95是突觸活性區(qū)突觸后膜下方與胞漿相連的致密物質(zhì)，而其中的PSD-95也稱作突觸相關蛋白90(synapse-associated protein 90，SAP-90)，是在谷氨酸能突觸后致密區(qū)的一類特殊蛋白質(zhì)，具有維持突觸正常結構及突觸可塑性的作用，從而保證突觸信號正常傳遞[14-15]。PSD-95可介導逆行性信號傳遞，增加突觸前膜突觸素的表達，提高阿爾茨海默病大鼠的空間學習記憶能力[15]。通過Western blot實驗檢測血管性癡呆小鼠受損海馬的SYP和PSD-95表達，探討DHEA調(diào)控血管性癡呆小鼠學習記憶的機制。實驗結果發(fā)現(xiàn)，血管性癡呆小鼠海馬的SYP和PSD-95蛋白表達水平顯著下降，DHEA組可顯著提高SYP和PSD-95蛋白表達水平的表達。結果提示DHEA可能是通過調(diào)節(jié)海馬SYP和PSD-9的表達，發(fā)揮調(diào)節(jié)突觸功能，減輕血管性癡呆小鼠突觸損傷的作用。

綜上所述，本實驗研究發(fā)現(xiàn)DHEA具有改善血管性癡呆小鼠的學習和空間記憶障礙的作用，而且上調(diào)NeuN、SYP和PSD-95的蛋白表達。提示其作用機制可能與減少神經(jīng)元的丟失，降低神經(jīng)元的突觸損傷，調(diào)節(jié)突觸功能有關。

為了進一步研究DHEA對血管性癡呆小鼠的學習與記憶能力的影響，探討其作用機制，下一步將從以下3個方面進行實驗研究：(1)進行形態(tài)學實驗(例如尼氏染色、免疫組化、電鏡等)，驗證DHEA減少神經(jīng)元丟失和改善突觸可塑性的作用；同時可通過電鏡觀察細胞的形態(tài)和超微結構，從形態(tài)學觀察DHEA抑制VD小鼠海馬神經(jīng)元的丟失作用是否與其調(diào)節(jié)凋亡和自噬有關。(2)采用Western blot及免疫組化方法，考察DHEA能否具有調(diào)控VD小鼠海馬神經(jīng)元的凋亡相關蛋白(Bcl-2和cleaved caspase-3)和自噬的相關蛋白(beclin-1和LC3)表達的作用。(3)使用sigma-1R KO小鼠和sigma-1R的激動劑及拮抗劑，研究其作用是否與激動sigma-1R有關，并且研究其作用與神經(jīng)營養(yǎng)因子之間的關系。我們將通過這些實驗探究DHEA在血管性癡呆中的價值，為開發(fā)新的治療血管性癡呆藥物提供新的思路及理論基礎。