范東艷，王 蘋，任海龍，周余來，石 艷

(1.西藏大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，西藏 拉薩 850000； 2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科，吉林 長春 130021；3.吉林大學(xué)藥學(xué)院再生醫(yī)學(xué)系，吉林 長春 130021；4.吉林大學(xué)藥學(xué)院藥學(xué)系，吉林 長春 130021)

海拔 3 000 m 以上的地區(qū)稱為醫(yī)學(xué)意義上的高原。我國高原(海拔 3 000 m 以上)面積占國土陸地總面積的 33%以上，而且有漫長的邊境線位于高原之上，高原地區(qū)空氣稀薄，氧分壓低，導(dǎo)致低壓性缺氧，因此人體快速進(jìn)入海拔 3 000 m 以上的高原缺氧環(huán)境地區(qū)可導(dǎo)致機(jī)體各器官功能的嚴(yán)重?fù)p傷，甚至發(fā)生急性重癥高原病，這對初入高原人群的生命安全構(gòu)成極大的威脅[1-2]。隨著我國西部大開發(fā)戰(zhàn)略實(shí)施，高原列車的開通和高原航空業(yè)的發(fā)展，越來越多世居平原地區(qū)的人群進(jìn)入西藏旅游、工作和定居。 研究高原環(huán)境對人體及其子代的影響對于保障高原建設(shè)者和世居高原人群的健康、邊疆地區(qū)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展以及拓寬人類生存空間, 順利實(shí)施西部大開發(fā)戰(zhàn)略具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和深遠(yuǎn)的歷史意義。

目前多數(shù)研究者認(rèn)為疾病是環(huán)境因素與遺傳因素相互作用的結(jié)果。研究[3]已經(jīng)證實(shí)：缺氧是影響內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的常見應(yīng)激之一，也是胎兒遭受最重要的、與臨床最相關(guān)的應(yīng)激。 孕婦居住于高海拔環(huán)境中會導(dǎo)致胎兒長期慢性缺氧, 而胎兒宮內(nèi)缺氧又是先天性心臟病的一個(gè)十分重要的誘因[4-6]。高原缺氧對動物子代心、腦和肺等臟器影響的研究尚未見報(bào)道。本研究以移居高原大鼠子代作為研究對象，探討高原低壓低氧對動物臟器發(fā)育及形態(tài)的影響，以期為缺氧性疾病防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物、試劑和主要儀器 Wistar大鼠，56只，雌雄比例為3∶1，購于北京市維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SCXK(京)2012-0001；多聚甲醛(001219，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)；正置顯微鏡(Nikon ECLIPSE 80i，日本尼康公司)，石蠟切片機(jī)(LEICA-2455，德國 LEICA 公司)。

1.2 高原移居孕鼠模型制備 將生活在平原地區(qū)(北京，平均海拔33 m、1個(gè)大氣壓、平均氣溫12.3℃)8周齡大鼠(雄性14只，雌性42只)移居到高原地區(qū)(拉薩市，平均海拔3 600 m、0.7個(gè)大氣壓、平均氣溫7.4℃)，動物適應(yīng) 1周后，大鼠按雌雄3∶1比例合籠受孕，所有孕鼠均自然分娩。仔鼠每窩隨機(jī)留 8 只飼養(yǎng)，以避免奶水?dāng)z入不足對新生仔鼠生長的影響。子代大鼠滿3周后斷乳，根據(jù)肛門與生殖突間的距離并結(jié)合乳狀突的有無來判斷性別，雌雄分籠，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。

1.3 標(biāo)本采集 子代大鼠于出生后1、3和6月齡，每組隨機(jī)取仔鼠雌雄各 5 只，同一時(shí)間點(diǎn)用電子天平(精確到 0.01 g)測定體質(zhì)量及腦、心、肺、肝和腎等主要臟器的質(zhì)量(各臟器離體后去殘血及殘留脂肪、結(jié)締組織，用生理鹽水漂洗擦干后稱凈質(zhì)量),用 4℃預(yù)冷的 0.1 mol·L-1、pH 7.4 的 PBS溶液沖洗 3 次，濾紙吸干水分后稱質(zhì)量。取部分心肌、腦、肺組織置于 10%的甲醛固定液中 4℃固定 12 h，常規(guī)石蠟包埋，HE 染色(心肌順心臟長軸方向在左心室和右心室各取材一塊，腦取大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)、中腦區(qū)和小腦區(qū)3個(gè)冠狀切，左右肺與主支氣管垂直方向各取材一塊)。

1.4 行為學(xué)檢測 每組隨機(jī)抽取45只仔鼠進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)、曠場實(shí)驗(yàn)和拒俘反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。仔鼠出生2周后進(jìn)行游泳訓(xùn)練，每隔3 d訓(xùn)練1次，在出生第4周進(jìn)行正式行為學(xué)檢測。檢測時(shí)間分別在1、3 和6月齡。

2 結(jié) 果

2.1 高原移居孕鼠及子代大鼠發(fā)育的一般情況 平原移居高原的孕鼠飲食正常，無早產(chǎn)和死亡。孕鼠平均每窩產(chǎn)仔8～10只，共計(jì)產(chǎn)仔345只。仔鼠體質(zhì)量增長為1.0～1.5 g·d-1。有部分仔鼠出現(xiàn)采食量低和覓食困難的現(xiàn)象，15只仔鼠在出生后3～5 d后陸續(xù)死亡，死亡率為4.3%。與1月齡子鼠比較，6月齡子鼠體質(zhì)量明顯增加(P<0.05)。不同月齡子鼠的體質(zhì)量和臟器/體質(zhì)量比見表1。

表1 不同月齡子鼠的體質(zhì)量和臟器/體質(zhì)量比

*P<0.05vs1 month.

2.2 高原移居大鼠子代行為學(xué) 45只仔鼠在水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測過程中未出現(xiàn)溺水和死亡情況。每一時(shí)間點(diǎn)每只仔鼠找到水中平臺的時(shí)間，其中3月齡有7只仔鼠(3雌4雄)找到水中平臺的時(shí)間低于其他仔鼠，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其他時(shí)間點(diǎn)各組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。曠場實(shí)驗(yàn)中，其中1月齡有6只仔鼠(2雌4雄)表現(xiàn)為中央?yún)^(qū)停留時(shí)間高于其他仔鼠，其他時(shí)間點(diǎn)各組比較無明顯差異。拒俘反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中各時(shí)間點(diǎn)所有動物表現(xiàn)基本一致。

2.3 高原移居大鼠子代心、腦和肺組織病理學(xué)表現(xiàn) 平原移居高原孕鼠子代中有部分仔鼠出現(xiàn)不同程度的心、腦和肺組織病理損傷。1、3和6月齡仔鼠心、腦和肺組織進(jìn)行HE染色后鏡下表現(xiàn)：1月齡仔鼠中有7只心肌間質(zhì)存在大量淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤，心肌間質(zhì)及小靜脈明顯淤血，心肌細(xì)胞發(fā)生凝固性壞死，胞核消失，但細(xì)胞輪廓仍保存；3月齡仔鼠中有10只心肌間質(zhì)內(nèi)有炎細(xì)胞浸潤，心肌細(xì)胞肥大，胞核消失，但細(xì)胞輪廓仍保存；6月齡仔鼠中10只心肌間質(zhì)內(nèi)有炎細(xì)胞浸潤，心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，胞核消失，胞質(zhì)溶解，心肌間質(zhì)及血管明顯淤血，部分心肌纖維呈不規(guī)則斷裂，心肌間隙擴(kuò)大(圖1，見插頁二)。1月齡仔鼠中9只腦組織中有玻璃樣小體形成，散在分布，其內(nèi)為淡伊紅色均質(zhì)毛玻璃樣變化，小體內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞染色淡，胞核不易辨認(rèn)或消失；3月齡仔鼠中9只腦組織結(jié)構(gòu)疏松呈篩網(wǎng)狀，空泡樣變化，壞死灶內(nèi)染色減退，可見較多淋巴細(xì)胞和泡沫細(xì)胞及大量毛細(xì)血管高度擴(kuò)張，明顯充血，壞死灶中有些神經(jīng)元輪廓仍保存，胞質(zhì)嗜堿性增強(qiáng)，神經(jīng)元胞體變形，胞核固縮、溶解或消失；6月齡仔鼠中有7只腦組織中有玻璃樣小體形成，結(jié)構(gòu)疏松呈篩網(wǎng)狀，空泡樣變化，壞死灶內(nèi)染色減退，可見較多泡沫細(xì)胞，毛細(xì)血管高度擴(kuò)張，明顯充血(圖2，見插頁二)。1月齡仔鼠中有5只肺組織內(nèi)部分肺泡壁增生變厚，內(nèi)有大量淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞浸潤，肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張充血；3月齡仔鼠中有7只肺組織內(nèi)大部分肺泡壁增生變厚，內(nèi)有大量淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞浸潤，肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張充血；6月齡仔鼠中有7只肺組織部分肺泡壁增生變厚，內(nèi)有大量淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞浸潤，肺間質(zhì)有淡伊紅色水腫液。肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張淤血，血管內(nèi)部分紅細(xì)胞液化，壞死(圖3，見插頁二)。

3 討 論

研究[7]表明：影響高原地區(qū)胎兒生長的因素包括產(chǎn)婦的生理狀態(tài)(即母體氧氣的供應(yīng)量和運(yùn)送到子宮胎盤循環(huán)的營養(yǎng)等) 和胎盤因素等。隨著高原地區(qū)經(jīng)濟(jì)建設(shè)的發(fā)展，大量人員從平原地區(qū)到達(dá)高原地區(qū)，因此深入研究高原缺氧環(huán)境對胎兒生長的影響，對臨床和公共健康有重要的意義，可以有效地提高高原新生兒的出生質(zhì)量，降低出生缺陷率。慢性缺氧可以影響高原移居孕產(chǎn)婦妊娠和胎兒生長，而高原世居孕婦子宮動脈血流較高，可保護(hù)胎兒生長[8-11]。

本研究利用西藏特有的高原地理?xiàng)l件，復(fù)制孕鼠高原移居模型，對高原移居孕鼠子代發(fā)育進(jìn)行了一般情況觀察，通過Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)、曠場實(shí)驗(yàn)和拒俘反應(yīng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了仔鼠行為學(xué)檢測；利用HE染色檢測仔鼠不同月齡心、腦和肺組織的病理學(xué)改變等，初步闡明高原缺氧環(huán)境對高原移居孕鼠子代發(fā)育的影響，為進(jìn)一步研究缺氧對組織臟器發(fā)育的影響提供理論依據(jù)。

我國是世界上高原面積最大的國家之一，主要分布在西部。隨著我國西部大開發(fā)和“一帶一路”國家發(fā)展戰(zhàn)略的穩(wěn)步推進(jìn)，越來越多的人進(jìn)駐高原工作或者旅游[12]。先天性心臟損傷可導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)改變和心肌微結(jié)構(gòu)受損，由此引發(fā)先天性心臟病和心肌病的發(fā)生，在高原地區(qū)常見多發(fā)。國內(nèi)外已有多項(xiàng)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)分析及相關(guān)研究間接顯示先天性心臟損傷的發(fā)生與母體妊娠期缺氧存在一定聯(lián)系[13-14]，但母體妊娠期處于缺氧環(huán)境對胎兒心臟發(fā)育的確切病理生理影響尚不明確。揭示心臟病的病因一直是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，但致病因素及發(fā)病機(jī)制至今仍不明確。目前大部分研究者認(rèn)為：先天性心臟損傷的發(fā)病是遺傳因素和環(huán)境因素相互作用所引起的一個(gè)復(fù)雜過程，但其具體過程尚不明確。高原環(huán)境高海拔、低溫、低壓且缺氧。早期胚胎的心臟發(fā)育對環(huán)境因素高度敏感，其細(xì)胞增殖、分化和凋亡等發(fā)育過程均易受到外界因素影響。研究[15-16]顯示：當(dāng)母體處于低氧環(huán)境，動脈氧分壓降為40 mmHg時(shí)，其體內(nèi)胎兒的動脈氧分壓可降至10～12 mmHg，胎兒處于缺氧狀態(tài)。

低壓低氧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激會對多個(gè)器官造成損傷，特別是腦組織。大腦組織耗氧量大，含有高濃度的不飽和脂肪酸以及豐富的金屬離子，同時(shí)抗氧化酶的水平較低，這些因素使其對高原缺氧造成的氧化應(yīng)激非常敏感[17]。研究[18-20]表明：低壓低氧嚴(yán)重影響腦組織結(jié)構(gòu)和功能，特別是神經(jīng)認(rèn)知功能和空間記憶能力。雖然低壓低氧導(dǎo)致腦損傷的機(jī)制尚不完全明確，但是目前公認(rèn)活性氧簇(ROS)的過度蓄積是造成損傷的重要原因之一[21]。

動物實(shí)驗(yàn)[22]表明：母鼠在妊娠期最后1 d氧濃度控制為10%，則幼鼠在出生后 1～2 h 出現(xiàn)肺容積增加延遲、遠(yuǎn)端球囊擴(kuò)張，影響氣體交換，氣體交換面積減少，并在出生后7～30 d加速肺泡壁變薄。

本研究利用水迷宮實(shí)驗(yàn)主要是檢測實(shí)驗(yàn)動物工作學(xué)習(xí)記憶方面的功能，45只受試仔鼠中有7只仔鼠不能在相應(yīng)的時(shí)間內(nèi)找到水中的平臺，說明這7只受試動物學(xué)習(xí)或記憶方面欠缺；曠場實(shí)驗(yàn)中有6只受試動物表現(xiàn)出中央?yún)^(qū)停留時(shí)間長，提示動物行為有異常；拒俘反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中受試動物本能攻擊性表現(xiàn)正常。根據(jù)以上行為學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)高原移居孕鼠子代有部分出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常現(xiàn)象，推測可能與缺氧環(huán)境有關(guān)。