施 龍,丁留成，薛 珺，熊 宇，衛(wèi)中慶

南京醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院(南京 210000)

主題詞 糖尿病 實驗動物 四磨湯 大鼠

糖尿病膀胱功能障礙是糖尿病的常見并發(fā)癥，可引起多種膀胱功能損害，包括感覺功能障礙、逼尿肌反射亢進或減退、收縮力增強或減弱，逐漸進展為糖尿病神經(jīng)源性膀胱，患者生活甚至生命受到很大威脅[1]。膀胱逼尿肌、尿道、自主神經(jīng)和尿路上皮等結(jié)構(gòu)的功能紊亂是目前許多國內(nèi)外專家學者認可的主要原因[2]。中醫(yī)將其歸為“消渴”、“癃閉”、“淋證(勞淋)”一類，表現(xiàn)為本虛標實之證，因氣郁、血瘀、水停、陰陽虛衰最終導(dǎo)致腎與膀胱發(fā)生病變，與肺、脾聯(lián)系緊密。臨床表現(xiàn)為尿等待、尿無力、小便頻繁但尿量少，重者出現(xiàn)排尿困難、尿潴留，有時也表現(xiàn)為尿失禁。消渴日久，主要是因為腎氣受損，陰陽失調(diào)，使中氣下陷或命門火衰，無法蒸騰氣化，最后致使膀胱尿道功能障礙[3]。四磨湯口服液是依照明代《痘疹金鏡錄》中的四磨湯研制出來的，由檳榔、枳殼、木香及烏藥組方而成，該方藥物組成雖簡單，但已普遍用于內(nèi)外婦兒各科并且獲得了良好的治療效果。吳深濤根據(jù)該病出現(xiàn)排尿異常之體征及“久病脾腎陽虛”之病機，在宋代嚴用和《濟生方》四磨湯合少腹逐瘀湯加減，意在扶正固本，溫陽化氣，通調(diào)水道，患者不僅排尿癥狀得到很大的改善，且對防治尿路感染有一定作用[4]，但其具體的作用機制尚未闡明。本文運用四磨湯口服液對糖尿病膀胱模型大鼠進行灌胃治療，從而探討四磨湯口服液對糖尿病膀胱大鼠膀胱相關(guān)壓力參數(shù)的影響及通過組織層面上HE染色、Masson染色的觀察，為其臨床診治提供新的方法。

材料與方法

1 材 料

1.1 實驗對象:SD雌性大鼠，體重160～220 g，南京大學動物實驗中心提供，許可證號:SYXK(蘇) 2016-0002;實驗大鼠在南京醫(yī)科大學動物實驗中心進行喂養(yǎng)，符合SPF級要求，許可證號: 2016-0016。

1.2 實驗試劑與儀器:鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ)、檸檬酸、檸檬酸鈉、四磨湯口服液，血糖測定儀與血糖試紙均購于美國強生公司，尿動力學分析儀(MedLab生物信號采集處理系統(tǒng)V6.5),DXL-D大鼠新型代謝籠(南京醫(yī)科大學動物實驗室)，電子稱(南京醫(yī)科大學五臺動物房)；無水乙醇；石蠟包埋機(型號KD-BM)；石蠟切片機(Thermo scientific, FINESSEME+)、二甲苯(國藥集團，100023418)、蘇木精液染色(海貝索生物技術(shù)有限公司，BA-4097)、Masson三色染色液(武漢谷歌生物科技有限公司，G1006)、顯微鏡(Leica DMR);染色機(Lecia ST5010)。

2 實驗方法

2.1 造模：適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，健康對照組正常喂養(yǎng)，糖尿病模型組大鼠依據(jù)體重一次性腹腔注射50 mg/kg濃度為1%的STZ溶液(檸檬酸和檸檬酸鈉按照1∶1配置而成的緩沖液，pH4.2)，3 d后剪尾采血，測血糖>16.7 mmol/L表明造模成功。

2.2 實驗分組和灌藥：將34只SD大鼠隨機分為健康對照組10只，糖尿病模型組、四磨湯治療組各12只。四磨湯治療組經(jīng)換算每日一次四磨湯口服液按7.56 /ml(kg·d)，灌胃12周。

2.3 觀察對象：行為學表現(xiàn)，動物毛發(fā)的色澤、活動狀況、飲水量、飲食量、體重變化、精神狀態(tài)等。糖代謝情況，定期測定血糖，應(yīng)用代謝籠記錄飲食量、排尿量、飲水量等參數(shù)。尿動力學檢測，每組大鼠按照12 m1/kg腹腔注射3.6%水合氯醛，先行下腹部膀胱頂部造瘺，導(dǎo)管插入后封閉瘺口，通過三通管使導(dǎo)管與壓力感受器和微量灌注泵連接，排空小便后，以30 ml/h的速度向膀胱泵入常溫等滲鹽水，當排尿時，灌注暫停,記下排尿時間、逼尿肌壓等，并通過計算得到膀胱順應(yīng)性數(shù)值。膀胱組織形態(tài)學觀察即大鼠處死后取出膀胱組織，4%多聚甲醛固定，無水乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切成約4 μm的組織片，常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)、麥松(Masson)染色，光鏡觀察。

結(jié) 果

1 行為學表現(xiàn) 健康對照組大鼠飲食正常，體重增加，毛發(fā)顏色致密，有光澤。各糖尿病模型組大鼠出現(xiàn) “三多一少”的糖尿病征象，并伴有精神萎靡、活動低下、毛色晦暗等。健康對照組大鼠沒有死亡的現(xiàn)象，糖尿病模型組、四磨湯治療組大鼠分別死2和4只，可能與STZ使胰島B細胞大量破壞、大鼠很難耐受持續(xù)高血糖狀態(tài)有關(guān)。第0周時，各組大鼠體重無明顯差別(P>0.05)，造模后第8周和第12周時，糖尿病模型各組大鼠體重與健康對照組大鼠相比偏低(P<0.05)，見表1。

表1 不同時間各組大鼠體重比較(g)

2 四磨湯口服液對血糖的影響 造模第0周(即STZ注射第3天)時，糖尿病造模各組大鼠血糖明顯上升，與健康對照組相比有明顯的統(tǒng)計學差別(P<0.05)，提示糖尿病大鼠模型制備成功。血糖在造模組中不同時段無明顯差別，提示模型相對穩(wěn)定(P>0. 05)，見表2。說明書明確表明強生血糖儀的測量上限為27.80 mmol/L，超過此值顯示為“High”，所以上述部分組別血糖值用(27.80±0.00) mmol/L標記。

表2 各組大鼠血糖比較(mmol/L)

3 代謝相關(guān)指標 代謝籠指標提示12周時糖尿病大鼠的食物攝入量、尿量和飲水量都高于健康對照組(P<0.05)。四磨湯治療組食量、尿量和飲水量與糖尿病模型組比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠代謝籠指標比較 (g)

4 尿動力學 模型組排尿時間(5.42±1.04)s、順應(yīng)性(5. 75±0.94)s/mmH2O指標上較健康對照組(2.12±0.45)s、(1.48±0.37)s/mmH2O明顯增加，且最大逼尿肌壓(53.44±4.28) mmH2O也較健康對照組(63.50±2.92)mmH2O明顯下降，兩者比較具有明顯差異(P<0.05)。四磨湯治療組在大鼠排尿時間(2. 94±0.25)s和順應(yīng)性(2. 61±0.51) s/mmH2O優(yōu)于模型組(P<0.05)。見表4。

表4 第16周時各組大鼠尿動力學指標比較

5 殘余尿量及膀胱濕重 與健康對照組相比，模型組與四磨湯治療組殘余尿量與膀胱濕重明顯增加，二者之間有明顯差異(P>0.05)。四磨湯治療組和模型組相比，治療組大鼠殘余尿量和膀胱濕重較各組有改善趨勢但與模型組比較無統(tǒng)計學差別(P>0.05)。見表5。

表5 第16周時每組大鼠殘余尿量及膀胱濕重比較

6 膀胱組織形態(tài)學結(jié)果 HE染色圖片以光鏡觀察各組大鼠的膀胱組織，可以見到健康對照組大鼠的膀胱逼尿肌肌束排列緊密，細胞大小及形態(tài)正常，肌束間隙致密有結(jié)締組織，神經(jīng)束易見。其余各造模組大鼠的膀胱逼尿肌層有增厚現(xiàn)象，肌細胞肥大，形態(tài)多樣，肌束排列紊亂有斷裂，結(jié)構(gòu)松散，肌束間間隙明顯增寬，血管有充血，神經(jīng)束減少。說明糖尿病大鼠的膀胱結(jié)構(gòu)明顯異常，經(jīng)過藥物治療后可改善糖尿病膀胱的形態(tài)。Masson染色圖片示：平滑肌肌纖維含量顯著減少，細胞外纖維化增多，治療組大鼠與模型組相比纖維化有一定的改善。

討 論

糖尿病神經(jīng)源性膀胱是糖尿病晚期的嚴重并發(fā)癥，主要是高血糖導(dǎo)致的肌源性及神經(jīng)源性病變和多尿引起逼尿肌收縮功能受損[5]。糖尿病膀胱神經(jīng)病變主要包括植物神經(jīng)病變，膀胱感覺神經(jīng)功能障礙，膽堿能(主要是M受體尤其是M3受體介導(dǎo))和非膽堿能神經(jīng)方面障礙[6]。有報道[7]膀胱舒張功能障也是植物神經(jīng)病變的重要組成部分，糖尿病膀胱逼尿肌損害出現(xiàn)在各個時間段內(nèi)且每個時間段內(nèi)B3受體含量都增加，在糖尿病膀胱病變的過程中腎上腺素能B3受體有著重要的意義。戴遲兵等[8]認為自主神經(jīng)病變、平滑肌病變、腸道Cajal細胞的缺失都是糖尿病胃動力障礙的病因，而胃腸激素分泌失調(diào)，如SP(substance P)、VIP(vasoactive intestinal peptide)及nNOS(neurogenic nitric oxide synthase)的失調(diào)也是糖尿病胃動力障礙的致病因素，新近發(fā)現(xiàn)的胃腸激素Ghrelin陽性神經(jīng)元在糖尿病模型中有減少趨勢，CGRP(calcitonin gene-related peptide)隨著糖尿病病程波動也可能與糖尿病胃腸動力障礙有關(guān)，四磨湯口服液可以針對上述部分病因改善糖尿病胃輕癱的癥狀。四磨湯口服液由檳榔、枳殼、木香及烏藥組方而成，且單藥研究發(fā)現(xiàn)檳榔和枳殼的活性成分檳榔堿和橙皮苷都可加強胃腸平滑肌收縮[9]。李紹磊等[10]認為四磨湯口服液具有類似M受體激動劑效應(yīng)，主要是通過M3受體介導(dǎo)。有人報導(dǎo)膀胱逼尿肌細胞中的M受體主要是M2和M3受體且M3受體可直接參與逼尿肌細胞收縮，與M受體激動劑結(jié)合后會誘導(dǎo)逼尿肌細胞的收縮[11]；糖尿病膀胱時膀胱內(nèi)的激素分泌也會失調(diào)，如SP、VIP、nNOS及CGRP等[12],四磨湯口服液是否會通過該途徑影響糖尿病膀胱逼尿肌的功能尚需進一步研究。依據(jù)測定的血糖值，各造模組之間空腹血糖的差別無明顯統(tǒng)計學意義，所以四磨湯口服液灌胃對大鼠體內(nèi)高血糖狀態(tài)并無明顯影響，表明四磨湯口服液無法徹底阻斷糖尿病膀胱的發(fā)生，但四磨湯口服液灌胃后對糖尿病膀胱發(fā)生起到一定的保護作用，增加逼尿肌的收縮強度，進而改善糖尿病膀胱排尿障礙。但是四磨湯口服液如何對糖尿病膀胱產(chǎn)生作用，目前尚未明確。本研究通過觀察四磨湯口服液灌胃干預(yù)大鼠糖尿病膀胱后通過尿動力學中重要參數(shù)的變化及通過組織層面上HE染色、Masson染色的觀察，以初步探討四磨湯口服液對糖尿病性膀胱大鼠膀胱排尿功能的改善作用機制。

實驗第0周時，各糖尿病大鼠體重明顯減輕，血糖顯著升高，尿量、食量及飲水量明顯增加，說明糖尿病大鼠模型造模成功;第16周時，糖尿病大鼠殘余尿量及膀胱濕重顯著增加，表明糖尿病大鼠已出現(xiàn)糖尿病膀胱功能障礙的征象。糖尿病大鼠膀胱濕重與健康對照組比較明顯增加，可能是多尿、膀胱逼尿肌功能障礙和神經(jīng)病變，致使膀胱逼尿肌肥厚，間質(zhì)和膠原成分增加。尿動力學檢查發(fā)現(xiàn)模型組大鼠排尿時間明顯延長、排尿過程中最大逼尿肌壓降低、殘余尿量增加，表明逼尿肌收縮功能受損，也從功能學方面印證了造模的成功，為四磨湯口服液干預(yù)糖尿病膀胱的研究提供了良好的動物模型。受限于大鼠膀胱有限的體積，非麻醉情形下置入測壓管并固定有一定的難度，所以本實驗選擇在麻醉狀態(tài)下進行尿動力學檢查，與清醒狀態(tài)下的該檢查結(jié)果有一定的差異，將來我們會進一步改進大鼠尿動力學檢查。

在本研究實驗第16周，四磨湯口服液治療組大鼠的膀胱排尿時間、順應(yīng)性、濕重及殘余尿量，均低于糖尿病模型組，可見四磨湯口服液可改善糖尿病膀胱排尿功能障礙。本實驗尚需檢測大鼠膀胱組織的受體水平，從而從分子機制水平做進一步分析，探討四磨湯口服液是通過哪種途徑來改善糖尿病膀胱排尿功能。大鼠殘余尿量是排尿后通過膀胱測壓管抽空膀胱內(nèi)剩余尿液來計量的，因膀胱測壓管中有等滲鹽水會導(dǎo)致健康對照組大鼠殘余尿量增加，也是導(dǎo)致測量誤差的原因之一，以后我們將改進。通過組織層面上HE染色、Masson染色的觀察，可以看出經(jīng)過四磨湯藥物治療后可改善糖尿病膀胱的形態(tài)及逼尿肌纖維化的程度。

本研究表明四磨湯可在不干擾血糖的情況下，改善糖尿病膀胱逼尿肌功能，對改善糖尿病膀胱功能障礙有一定的作用。未使用降糖藥物作為基礎(chǔ)干預(yù)手段、沒有進行膀胱組織形態(tài)學的檢測以及四磨湯口服液沒有進一細化低、中、高濃度對糖尿病膀胱的影響是本實驗研究的不足之處。今后打算在該方與降糖藥聯(lián)合應(yīng)用、分子作用機制、方藥量效等方面作進一步研究，從而為防治糖尿病神經(jīng)源性膀胱提供更多方法?？傊?，在糖尿病導(dǎo)致糖尿病膀胱形成的過程中，膀胱逼尿肌功能障礙起著非常重要的作用。四磨湯口服液可通過增強逼尿肌收縮力和減少殘尿量有助于改善糖尿病膀胱排尿功能障礙。因此，四磨湯口服液可能成為早期糖尿病性膀胱功能障礙潛在的治療手段之一。