黃丹娟　馬建強　馬春雷　王松琳　陳亮　毛迎新　陳勛

摘要：【目的】通過人工繪制品種鑒別圖（Manual cultivar identification diagram，MCID）快速區(qū)分鑒別湖北茶樹品種，為湖北茶樹種質(zhì)資源評價、品種保護及苗木純度早期鑒定提供技術支持?！痉椒ā恳院笔?3個優(yōu)良茶樹品種為材料，利用30對均勻分布于遺傳連鎖圖譜上的SSR熒光引物進行PCR擴增，并用熒光標記毛細管電泳檢測擴增產(chǎn)物以篩選出核心引物，利用MCID法構(gòu)建CID圖譜?！窘Y(jié)果】30對SSR引物共擴增出145個等位基因，各引物等位基因數(shù)為3～9個，平均每對引物為4.83個；共檢測到194個基因型，各引物檢測出的基因型為3～12個，平均每對引物6.47個；多態(tài)性信息量（PIC）為0.29～0.85，平均為0.58。13個茶樹品種的Neis遺傳距離為0.19～0.44。基于Neis遺傳距離，采用Neighbor-Joining（NJ）法可將13個品種分為三大類（Neis遺傳距離為0.16），結(jié)果表明地理來源相同的品種可能因為具有相似的遺傳背景而聚在一起，也可能因為親本來源不同而存在明顯的遺傳差異。利用篩選出的3對核心引物（TM547、TM552和TM107）可快速鑒別所有參試品種，通過MCID法構(gòu)建的CID圖譜可直觀看出各參試茶樹品種鑒定所需要的引物及其對應的基因型?！窘Y(jié)論】基于SSR熒光標記的茶樹品種MCID鑒定方法具有快速、準確、高效的特點，可用于湖北茶樹良種知識產(chǎn)權(quán)保護、苗期鑒定及品種區(qū)分。

關鍵詞： 茶樹；品種鑒定；SSR熒光標記；人工繪制品種鑒別圖（MCID）；湖北

中圖分類號： S571.103.7 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）06-1045-08

Abstract：【Objective】In order to provide theoretical basis for the evaluation of Hubei tea germplasm resources， protection of varieties and early identification of the purity of seedlings， manual cultivar identification diagram （MCID） was constructed to quickly distinguish and identify Hubei tea cultivars. 【Method】Thirty pairs of fluorescent SSR markers distributed evenly on the genetic linkage group were used to carried out PCR amplification of thirteen Hubei fine tea cultivars. Fluorescence labeled capillary electrophoresis was used to detect the amplification products and screen the core pri-mers. The cultivar identification diagram（CID） was drawn by MCID method. 【Result】Thirty pairs of SSR primers amplified 145 alleles， ranging from 3 to 9 alleles for each primer， with an average of 4.83. A total of 194 genotypes were detec-ted， and the genotypes detected by each primer were 3 to 12 with an average of 6.47. The range of polymorphism information content（PIC） was 0.29-0.85 with an average of 0.58. Relationship analysis showed that Neis genetic distance of the 13 tea cultivars was 0.19-0.44，and were classified into three groups by Neighbor-Joining（NJ） method based on Neis genetic distance（Neis genetic distance was 0.16）. It indicated that cultivars with the same geographical origin may grouped due to similar genetic backgrounds， or may also show great differences because of their different parental origin. Three pairs of SSR primers， TM547， TM552 and TM107， could rapidly identify all the tested cultivars. According to the CID map constructed by MCID method， the primers needed for the identification of various tea cultivars and their correspon-ding genotypes could be seen directly. 【Conclusion】The MCID method based on fluorescent SSR markers is rapid， accurate and efficient in identification of tea cultivars. It can support the intellectual property protection， seedling appraisal and variety identification of Hubei fine tea cultivars.

Key words： tea； cultivar identification； fluorescent SSR markers； manual cultivar identification diagram（MCID）； Hubei

0 引言

【研究意義】茶樹[Camellia sinensis（L.）O. Kuntze]為山茶科山茶屬灌木或小喬木，經(jīng)長期人工和自然選擇形成了具有穩(wěn)定及遺傳特性豐富多樣的品種資源。湖北省種茶歷史悠久，自然條件優(yōu)越，茶產(chǎn)業(yè)已成為宜昌、恩施等山地丘陵地區(qū)農(nóng)民脫貧致富的重要經(jīng)濟產(chǎn)業(yè)。目前，湖北省通過國家級審（認、鑒）定的茶樹品種有4個，通過省級審（認、鑒）定的茶樹品種有14個，其中1個獲得植物新品種權(quán)。隨著湖北省茶樹栽培面積的不斷擴大，越來越多的省內(nèi)優(yōu)良品種應用于茶樹生產(chǎn)（陳勛和龔自明，2017）。由于茶樹幼苗主要通過無性繁殖獲得，在母本枝條扦插、轉(zhuǎn)移、運輸和種植過程中極易造成品種混亂。因此，建立湖北省茶樹品種快速可靠的鑒定技術對茶樹良種知識產(chǎn)權(quán)的保護、苗期鑒定、品種區(qū)分及其產(chǎn)業(yè)發(fā)展均具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】傳統(tǒng)的形態(tài)學品種鑒定法難以鑒別遺傳背景相似、親緣關系較近的植物品種。隨著分子標記技術的快速發(fā)展，實現(xiàn)了從DNA分子水平上穩(wěn)定可靠地鑒定植物品種（Mukhopadhyay et al.，2016；張洪源等，2017）。其中，SSR標記具有重復性好、多態(tài)性高、數(shù)量豐富、呈共顯性且廣泛分布于基因組等優(yōu)點，已廣泛應用于茶樹種質(zhì)資源遺傳評價、遺傳圖譜構(gòu)建、品種鑒定及系譜分析（Yao et al.，2012；黃丹娟等，2016；Chang et al.，2017），也是目前分子指紋圖譜研究中應用最廣泛的遺傳標記（賀爾奇等，2016）。劉本英等（2012）利用22個SSR標記對28份云南無性系茶樹品種進行了DNA指紋圖譜分析，通過不同基因型組合，各品種均獲得一個22位數(shù)的指紋圖譜編號，可將不同品種或無性系完全區(qū)分開來。章志芳和馬建強（2012）采用EST-SSR標記對14個來自不同省份的茶樹品種進行DNA指紋鑒定，將4個核心標記擴增的等位基因譜帶組合轉(zhuǎn)化為計算機化的數(shù)字編號，繪制成可視化條形碼，結(jié)果顯示各品種均有唯一的指紋圖譜，可快速地鑒定參試品種。郭燕等（2016）利用篩選出的4對核心標記，構(gòu)建了貴州古茶樹種質(zhì)資源的分子指紋圖譜，各種質(zhì)均獲得一個18位數(shù)的指紋圖譜編號，可用于貴州古茶樹資源的保護及開發(fā)利用研究。Wang等（2016）利用SSR熒光標記電泳檢測技術，從33對SSR引物中篩選出6對核心引物，通過人工繪制品種鑒別示意圖（MCID）構(gòu)建了66個來自不同省份的茶樹品種鑒別圖（CID），從中可直觀地看出鑒定各品種所需要的SSR引物及其基因型。陳志輝等（2017）從38對SSR引物中篩選出7對擴增條帶少、多態(tài)性高的引物，利用其構(gòu)建了43個福建茶樹品種的DNA指紋圖譜，可清楚地區(qū)分各參試品種。王松琳等（2018）從62對SSR引物中篩選出3對核心引物，利用其構(gòu)建了16個白化、黃化茶樹品種的DNA指紋圖譜，結(jié)果表明，SSR標記在白化、黃化茶樹品種的鑒定方面具有很好的適用性。綜上所述，大多數(shù)研究均基于SSR引物的擴增譜帶轉(zhuǎn)化成DNA指紋圖譜而實現(xiàn)對大批量茶樹品種進行鑒定，但其缺點是無法直觀顯示鑒別過程。【本研究切入點】通過MCID可直觀顯示鑒別過程，找出各參試茶樹品種鑒定所需要的引物及其對應的基因型，從而快速鑒定出茶樹品種（Wang et al.，2011；許園園等，2016）。但目前鮮見基于SSR熒光標記的MCID快速鑒定湖北茶樹品種的研究報道。【擬解決的關鍵問題】利用30對均勻分布于茶樹遺傳連鎖圖譜上的SSR熒光標記引物，對13個湖北茶樹優(yōu)良品種進行PCR擴增，采用熒光標記毛細管電泳檢測擴增產(chǎn)物，從中篩選出核心引物，并利用MCID構(gòu)建CID圖譜，以期對13個茶樹品種在分子水平上進行快速準確區(qū)分，為湖北茶樹種質(zhì)資源評價、品種保護和苗木純度早期鑒定提供技術支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

采集中國農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所國家種質(zhì)杭州茶樹圃茶樹健康葉片，液氮冷凍后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩⒃嚨牟铇淦贩N名稱及遺傳背景見表1。SSR熒光引物由上海祥音生物科技有限公司合成。KAPA2G Fast Multiplex Mix購自北京普凱瑞生物科技有限公司。主要設備儀器：PCR擴增儀（Bio-Rad，美國）、高速大容量冷凍離心機（Beckman，美國）、ND-1000超微量分光光度計（Nanodrop，美國）和ABI 3730XL測序儀（ABI，美國）等。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 基因組DNA提取 采用改進的CTAB法（馬建強，2013）提取樣品基因組DNA，并用l%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量，用ND-1000超微量分光光度計檢測其濃度。

1. 2. 2 PCR擴增及產(chǎn)物檢測 30對SSR熒光引物的相關信息參考Ma等（2014）的文獻報道。PCR反應體系25.0 μL：20 ng/μL DNA模板1.0 μL，KAPA2G Fast Multiplex Mix 12.5 μL，10 μmol/L正、反向引物各1.0 μL，ddH2O補足至25.0 μL。擴增程序：94 ℃預變性15 min；94 ℃ 30 s，52～60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進行35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｃ毠茈娪緳z測參照黃丹娟（2016）的方法。

1. 2. 3 SSR引物多態(tài)性分析 采用PowerMarker統(tǒng)計每對引物在13個茶樹品種中擴增等位基因數(shù)（Na）、基因型數(shù)和多態(tài)性信息量（PIC）（Liu and Muse，2005）等，并計算各品種間的Neis遺傳距離?；贜eis遺傳距離進行Neighbor-Joining聚類分析。按照如下標準進一步篩選茶樹品種鑒定的SSR核心引物：（1）3≤等位位點數(shù)≤5；（2）5≤基因型數(shù)≤10；（3）4≤重復堿基個數(shù)≤6；（4）PIC≥0.5（王讓劍等，2016）。

1. 2. 4 CID圖譜繪制 根據(jù)SSR擴增圖譜，統(tǒng)計某一引物PCR擴增的13個茶樹品種條帶大小和基因型，將相同擴增譜帶的品種歸為一組，無此譜帶的歸為另一組。然后繼續(xù)添加引物逐步進行鑒別，直至將所有參試品種均清晰地區(qū)分開來。最后，根據(jù)每步完成的鑒別結(jié)果，人工繪制CID圖譜，將每一步所用的引物及多態(tài)性譜帶大?。╞p）同時標到CID圖譜的相應位置上。

2 結(jié)果與分析

2. 1 SSR引物多態(tài)性分析結(jié)果

由表2可知，30對SSR引物從13個茶樹品種中共擴增出145個等位基因，各引物擴增出的等位基因個數(shù)為3～9個，平均每對引物為4.83個；共檢測到194個基因型，各引物檢測出的基因型為3～12個，平均每對引物為6.47個；各引物擴增的PIC為0.29～0.85，平均為0.58，其中多態(tài)性較低（PIC<0.25）的引物數(shù)量為0對，多態(tài)性適中（0.250.50）的引物數(shù)量24對（占所有引物總數(shù)的80%），尤其以TM400引物的PIC最高，為0.85，擴增得到等位基因9個，基因型個數(shù)12個?？梢?，本研究選用的30對SSR引物多態(tài)性豐富，在品種鑒定方面具有較高的應用潛力。以TM551為例，由圖1可知，TM551在鄂茶4號、鄂茶5號和鄂茶12號檢測出帶型分別為132 bp+138 bp、126 bp+132 bp和120 bp+126 bp，電泳結(jié)果清晰明確，可直觀地將3個品種區(qū)分開。

2. 2 親緣關系分析結(jié)果

基于30對SSR多態(tài)性引物的擴增結(jié)果計算Neis遺傳距離，發(fā)現(xiàn)13個茶樹品種的Neis遺傳距離為0.19～0.44（表3）。其中，五峰310與五峰212遺傳距離最遠，其原因是二者均由五峰當?shù)厝后w種中選育而來，遺傳背景較近；鄂茶1號與鄂茶3號遺傳距離最遠，其原因可能是鄂茶1號為父母本均為福建省選育的品種，而鄂茶3號是在湖北咸寧當?shù)厝后w種中選育而來，地理來源較遠。

基于Neis遺傳距離，對13個茶樹品種進Neighbor-Joining聚類分析。從圖2可看出，當Neis遺傳距離為0.16時，13個茶樹品種聚為三大類。第Ⅰ大類包括鄂茶1號、鄂茶12號和鄂茶6號，均由湖北省農(nóng)業(yè)科學院果樹茶葉研究所育成，其中鄂茶1號和鄂茶12號聚為同一個亞類，親緣關系較近，其原因是二者均為福鼎大白茶的后代。第Ⅱ大類包括鄂茶7號、鄂茶3號、鄂茶2號、五峰212、五峰310和金茗1號，主要是從咸寧和五峰當?shù)厝后w種中選育而成，且地理來源相同的品種聚在同一個亞類。第Ⅲ大類包括鄂茶4號、鄂茶5號、鄂茶9號和鄂茶11號，其中鄂茶4號和鄂茶9號均從宜昌大葉種及其群體中選育而成，與由勁峰種自然雜交后代中選育而成的鄂茶5號聚在同一亞類，從龍井43自然雜交后代中選育而成的鄂茶11號則單獨為一個亞類?？梢?，地理來源相同的品種可能因為具有相似的遺傳背景而聚在一起，也可能因為親本來源不同而存在較大的遺傳差異。

2. 3 SSR分子標記鑒定及CID圖譜的構(gòu)建

綜合考慮30對引物擴增結(jié)果，以雜峰少為基本原則，并結(jié)合PIC、等位基因和基因型個數(shù)篩選標準，選取3對核心引物TM547、TM552和TM107，用于區(qū)分鑒別所有參試品種。根據(jù)3對核心引物擴增出的相應譜帶信息，構(gòu)建13個湖北茶樹品種的CID圖譜，如圖3所示。引物TM547擴增的DNA電泳圖譜可將13個茶樹品種分為五組，第一組包括4個品種，帶型為110 bp，表明TM547在這4個品種擴增出的等位基因均為純合；第二組和第四組均只有一個品種，分別為鄂茶6號和鄂茶2號，帶型為98 bp+116 bp和98 bp+104 bp，表明僅使用引物TM547即可將鄂茶6號和鄂茶2號鑒定出；第三組包括2個品種，帶型為110 bp+116 bp，第五組包括5個品種，帶型為104 bp+110 bp。即利用引物TM547尚無法鑒別出所有參試品種。利用TM552進一步鑒定第一組、第三組和第五組的品種，結(jié)果顯示，第一組的4個品種可全部鑒定出，帶型分別為197 bp、192 bp+202 bp、187 bp+192 bp和187 bp+202 bp；第三組的2個品種也可鑒定出，帶型為192 bp+197 bp和187 bp+192 bp；第五組的5個品種中僅五峰310在192 bp處出現(xiàn)特征譜帶，可鑒定出，其余4個品種仍無法鑒定。最后，利用引物TM107鑒定第五組的4個品種，結(jié)果顯示，這4個品種在146 bp+156 bp、141 bp、141 bp+156 bp和156 bp處均出現(xiàn)特征譜帶，均可被鑒定出。綜上所述，根據(jù)構(gòu)建的CID圖譜可直觀看出各參試茶樹品種鑒定所需要的引物及其對應的基因型，從而快速鑒定出茶樹品種。

3 討論

茶樹品種鑒定經(jīng)歷了形態(tài)學、細胞學、生物化學和分子標記等發(fā)展過程。其中，分子標記鑒定的準確性高，實用性強，尤其是SSR標記技術優(yōu)勢更突出，已廣泛應用于各研究領域。長期以來，SSR擴增產(chǎn)物的檢測多采用聚丙烯酰氨凝膠電泳，但其存在較大缺陷，如無法顯示產(chǎn)物片段的具體大小，在大規(guī)模、多批次的數(shù)據(jù)收集和分析中存在分析通量較低、數(shù)據(jù)記錄工作量過大等問題（郝晨陽等，2005）。為了避免這些缺陷對試驗數(shù)據(jù)造成的誤差，本研究采用SSR熒光標記毛細管電泳檢測技術，與聚丙烯酰胺凝膠電泳相比，該技術能準確獲取擴增產(chǎn)物大小，并實現(xiàn)數(shù)據(jù)收集和處理自動化，具有高效、準確、靈敏度高等優(yōu)點（高源等，2012）。目前，該技術已廣泛應用于茶樹DNA指紋圖譜的構(gòu)建（Tan et al.，2015；陳世軍等，2017；Liu et al.，2017），但其檢測成本較聚丙烯酰氨凝膠電泳高，尤其是當試驗材料數(shù)量較多時，需要合成大量的SSR熒光引物，消耗成本更大，因此，可根據(jù)實際情況，綜合考慮兩種檢測方法。

采用聚丙烯酰氨凝膠電泳和熒光標記毛細管電泳進行福建茶樹品種SSR鑒定，在篩選核心引物時均以等位基因少、條帶清晰、間隔明顯為原則，淘汰條帶多、密集、多態(tài)性豐富的引物（王讓劍等，2016；陳志輝等，2017）。本研究選用的30對SSR引物均具有豐富的多態(tài)性，從構(gòu)建的CID圖譜可看出，用其中3對SSR引物即可區(qū)分所有參試材料，效率較高，其原因是本研究采用的熒光標記毛細管電泳法分辨率和靈敏度均較高，可檢測出僅相差1～2個堿基的等位基因。如果采用聚丙烯酰氨凝膠電泳，由于其分辨率較低，當引物擴增的等位基因條帶較多或參試品種較多時，統(tǒng)計難度較大，易造成誤差。為了將構(gòu)建的CID圖譜廣泛應用于茶樹品種鑒定，本研究采用引物組合法，選擇TM547、TM552和TM107共3對核心引物進行CID圖譜構(gòu)建，其原因是這3對引物的基序堿基數(shù)分別為6、5和5個，即使利用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，也能得到較清晰易讀的條帶，減少由不同檢測方法帶來的等位基因大小和數(shù)量的判讀誤差。

目前，越來越多的茶樹優(yōu)良品種或品系來源于少數(shù)育種骨干親本，在性狀上表現(xiàn)出較高的相似性，僅使用傳統(tǒng)的形態(tài)學品種鑒定方法難以進行有效區(qū)分（Chen et al.，2007）。此外，構(gòu)建聚類分析樹狀圖僅顯示品種或種質(zhì)材料間的遺傳關系，無法作為品種鑒定的根本依據(jù)。構(gòu)建DNA指紋圖譜可準確鑒定大量茶樹品種，但無法直觀顯示鑒定過程。隨著品種鑒定方法的發(fā)展和完善，MCID較傳統(tǒng)鑒定方法有了較大突破，即根據(jù)引物擴增結(jié)果，具有特異性譜帶的品種被單獨區(qū)分出來，其余品種根據(jù)譜帶表現(xiàn)進行分組，再通過其他引物區(qū)別、分組，直到所有品種被鑒定出（張曉瑩等，2012）。Wang等（2016）從33對SSR引物中篩選出6對核心引物，構(gòu)建了66個茶樹品種的CID圖譜，該圖譜幾乎涵蓋了福建省所有無性系茶樹良種（53個）。本研究通過3對引物構(gòu)建了13個湖北茶樹品種的CID圖譜，可直觀顯示整個鑒別過程，快速找出各參試茶樹品種鑒定所需要的引物及其對應的基因型。當需要將新的茶樹品種添加到該CID圖譜時，可利用本研究所使用的3對引物對新品種進行PCR擴增，根據(jù)帶型將其標注在CID圖譜的相應位置上，以此獲得包括更多茶樹品種的CID圖譜。如果這30對引物無法鑒別新品種，則選用新引物再進行區(qū)分。通過上述方法可快速鑒定不明確的品種，有效打擊茶苗繁殖市場品種假冒行為，保護育種工作者權(quán)益，對實現(xiàn)茶樹種質(zhì)資源管理、苗木早期純度鑒定及促進茶樹品種知識產(chǎn)權(quán)的保護均具有重要意義。

4 結(jié)論

基于SSR熒光標記的茶樹品種MCID鑒定方法具有快速、準確、高效的特點，可用于湖北茶樹良種知識產(chǎn)權(quán)保護、苗期鑒定及品種區(qū)分。

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（責任編輯 陳 燕）