李飛龍 謝平金,3 柴生颋* 劉治軍 陳群群 劉柄辰,3

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院骨科，廣東 廣州 5100002. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 5104053. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)嶺南醫(yī)學(xué)研究中心中醫(yī)骨傷科學(xué)實驗室，廣東 廣州 510405

膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)作為膝關(guān)節(jié)軟骨變性、破壞及關(guān)節(jié)周圍骨質(zhì)增生為特征的慢性關(guān)節(jié)病[1]，多見于60歲以上人群[2]，臨床上表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)局部疼痛、晨僵、腫脹、活動受限，嚴(yán)重者可出現(xiàn)關(guān)節(jié)的畸形。隨年齡增長而發(fā)生率明顯增加，是引起老年人關(guān)節(jié)疼痛和功能障礙的主要原因，并最終可導(dǎo)致殘疾的風(fēng)險[3]。KOA的發(fā)病率目前正快速增長，故對于如何早期防治KOA已成為當(dāng)前研究熱點。川芎嗪作為活血化瘀類中藥川芎中提取的一種有效活性生物堿，在治療KOA的臨床及實驗研究已有相關(guān)報道。本研究通過觀察川芎嗪對實驗性大鼠KOA關(guān)節(jié)軟骨組織學(xué)評分、VEGF表達(dá)水平的影響來探討其防治早期KOA的機(jī)制，為治療膝骨性關(guān)節(jié)炎提供有效途徑和應(yīng)用依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1動物：健康3月齡雄性大鼠50只，體重180～220 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。

1.1.2主要試劑：磷酸川芎嗪片(麗珠集團(tuán)利民制藥廠，國藥準(zhǔn)字：H44024348)；塞來昔布(輝瑞制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字J20140072)；木瓜蛋白酶(上海源葉科技有限公司S10011,CAS:9001-73-4)；石蠟(國藥化學(xué)試劑有限公司)；蘇木素伊紅染色試劑盒(北京雷根生物技術(shù)有限公司)；中強(qiáng)度RIPA裂解液(FD008；弗德生物)；蛋白酶抑制劑混合物(FD1001；弗德生物)；100 mmol/L PMSF(FD100；弗德生物)蛋白磷酸酶抑制劑混合物(FD1002；弗德生物)；BCA蛋白定量試劑盒(FD2001；弗德生物)；5×蛋白上樣緩沖液(AR1112；博士德)；預(yù)染蛋白Marker(Fermentas)；Tris-base(V900483；Vetec)；甘氨酸(G800880；Macklin)；過硫酸銨(A801035；Macklin)；SDS(Biosharp)；丙烯酰胺(0341-1 kg；Amresco)；N.N-甲叉雙丙烯酰胺(N813086-100 g；Macklin)；PVDF膜 0.45 μm(Millipore)；PVDF膜 0.22 μm(Millipore)；脫脂奶粉(232100；BD)；TWEEN 20(Biosharp)；顯影定影試劑(國產(chǎn))TRIzol Reagent(DP424；天根)。

1.1.3主要設(shè)備：純水儀(重慶艾科浦)；電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；臺式高速離心機(jī)(SCIlogex)；磁力攪拌器(常州澳華儀器有限公司)；脫色搖床(北京六一儀器廠)；電泳儀(北京六一儀器廠)；水浴鍋(姜堰市天力醫(yī)療器械廠有限公司)；暗匣(廣東粵華醫(yī)療器械廠有限公司)；感光膠片(Kodak)；封口機(jī)PF(溫州市江南機(jī)械廠)；低溫冰箱(西門子)；掃描儀(Canon)；多功能酶標(biāo)儀(上?，F(xiàn)科儀器有限公司)；灰度分析軟件(Image J)。輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)(德國Leica)。

1.1.4溶液配制：轉(zhuǎn)移緩沖液(2 L)：甘氨酸 28.8 g，Tris4.84 g， 甲醇400 mL，加去離子水定溶至2 000 mL；電泳緩沖液(2 L)：Tris 6.06 g，甘氨酸37.54 g，SDS 2 g，加去離子水定溶至2 000 mL；TBS緩沖液(1 L)：1 mol/L Tris-HCl(pH=7.5)10 mL NaCl 8.8 g 加去離子水定溶至1 000 mL；30%丙烯酰胺(1 L)：丙烯酰胺290 g，BIS 10 g，加去離子水充分溶解后定溶至1 000 mL；非磷酸化蛋白酶抑制劑：每1 mL RIPA試劑中加入5 μL蛋白酶抑制劑和10 μL 100 mM的PMSF，混勻；磷酸化蛋白酶抑制劑：每1 mL RIPA試劑中同時加入5 μL蛋白酶抑制劑、10 μL 100 mM的PMSF、5 μL磷酸化蛋白酶抑制劑，混勻。

1.2 方法

1.2.1分組與造模：將實驗動物依據(jù)隨機(jī)分配的原則分為正常組、模型對照組、高劑量組、低劑量組和陽性對照組。每組10只，除正常組外，均采用木瓜蛋白酶關(guān)節(jié)腔注射建立大鼠 KOA 模型。在無菌條件下用 0.9%NaCl溶液配4%(W/V)木瓜蛋白酶溶液，于4 ℃恒溫冰箱儲存，至實驗前 4 h 取出室溫放置。將大鼠腹腔注射 10%水合氯醛麻醉，麻醉成功后雙膝關(guān)節(jié)備皮、消毒、屈曲約 45°，從髕骨下緣前內(nèi)側(cè)的膝眼向髁間窩方向進(jìn)針，明顯有落空感后，針尖抵達(dá)股骨內(nèi)側(cè)髁再回撤 2 mm，并注射木瓜蛋白酶，分別向雙側(cè)膝關(guān)節(jié)腔注入4%木瓜蛋白酶0.2 mL。每隔3 d注射1次，連續(xù)注射3次(即第1天、第4天、第7天注射)。注射后1周，觀察各組大鼠膝關(guān)節(jié)外觀，并在各組各取1只大鼠處死后，取關(guān)節(jié)軟骨行HE切片，驗證造模是否成功。

1.2.2干預(yù)方法：驗證造模成功后開始灌胃給藥治療，高劑量組、低劑量組按人和動物間體表面積折算的等效劑量比值計算，分別給予灌胃磷酸川芎嗪片TMP 100 和50 mg/kg(分別相當(dāng)于臨床用藥量的 20 和 10 倍)，每天用藥 1 次；陽性對照組灌服塞來昔布劑量為 24 mg/kg，每日定時給藥1次，正常組、模型組灌服等量的生理鹽水，每天1次，連續(xù)灌胃 6 周后處死，右膝脛骨平臺行組織切片觀察，左膝取軟骨組織進(jìn)行Western Blot蛋白檢測。所有SD大鼠均喂養(yǎng)在恒溫、恒濕的清潔環(huán)境中，環(huán)境溫度為(25±1)℃，濕度為68%，每天12 h 光照/黑暗，任意進(jìn)食飼養(yǎng)者提供的大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料和自來水。

1.2.3檢測指標(biāo)：①大體形態(tài)及切片染色觀察。治療結(jié)束后，遵循安樂死的原則將各組實驗鼠處死，解剖各組實驗鼠雙側(cè)膝關(guān)節(jié)并暴露關(guān)節(jié)軟骨，肉眼觀察關(guān)節(jié)軟骨光滑度、色澤、表面是否有糜爛及潰瘍、是否有纖維性增生及邊緣是否有骨贅形成等。右側(cè)膝關(guān)節(jié)脛骨平臺經(jīng)4%多聚甲醛4 ℃固定、脫鈣、脫水、透明、浸蠟、包埋，制作成石蠟標(biāo)本，行4～6 μm 厚切片。HE染色后在光鏡下觀察各組切片染色情況，采用改良Mankin法[4]對軟骨組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞、染色以及潮線的完整性評分，評分越高說明軟骨退變越嚴(yán)重。②Western Blot檢測。取左側(cè)膝關(guān)節(jié)脛骨平臺關(guān)節(jié)軟骨組織-80 ℃保存?zhèn)溆?，并根?jù)說明書配制全蛋白提取液，將軟骨組織置于全蛋白提取液中，利用勻漿器于冰上破碎軟骨組織。勻漿后，采用Braford 比色法測定樣品蛋白濃度。加入5×SDS蛋白上樣緩沖液(5∶1)，100 ℃煮沸5 min。-20 ℃保存?zhèn)溆?。分別至于濃縮膠和分離膠中電泳，350mA轉(zhuǎn)膜70 min。37封閉液中封閉1 h；將PVDF膜分別放入裝有3 mL稀釋后的VEGF抗體(稀釋比例1∶1 000，轉(zhuǎn)膜條件：300 mA恒流轉(zhuǎn)膜30 min，廠家：Abcam，貨號：Ab46154)，25 mL TBST洗滌PVDF膜3次，每次5 min；將PVDF膜放入含有3 mL辣根過氧化物酶標(biāo)記的稀釋二抗溶液的小槽內(nèi)，置于搖床上室溫平緩搖動40 min(二抗：HRP Goat anti-Rabbit IgG(廠家：BOSTER，貨號：BA1054，稀釋比例：1∶20 000，孵育條件：室溫孵育40 min)25 mL TBST洗滌PVDF膜3次，每次7 min；用化學(xué)發(fā)光顯色后進(jìn)行圖像分析，經(jīng)軟件分析，以VEGF/β-actin比值表示VEGF蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。若數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布且方差齊性，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD檢驗；若數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布但方差不齊，多組間比較采用Welch法和Brown-Forsythe法，多重比較采用Dunnett T3檢驗；以P<0.05為差異有顯著性意義。Western Blot檢測及PCR 結(jié)果采用 GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間比較采用雙尾t檢驗。P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 軟骨組織學(xué)觀察

實驗結(jié)束后，除正常組外，各組均出現(xiàn)不同程度的軟骨損傷，主要以股骨內(nèi)踝及內(nèi)側(cè)脛骨平臺顯著。如表1及圖1示，各組軟骨Mankin評分中，川芎嗪各劑量組和陽性對照組均高于正常組、且均低于模型組(P<0.05)，而陽性對照組評分低于川芎嗪低劑量組，但高于川芎嗪高劑量組(P<0.05)。

表1 實驗結(jié)束后軟骨組織Mankin評分

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05；與陽性對照組比較，#P<0.05

2.2 Western Blot檢測軟骨組織VEGF蛋白表達(dá)結(jié)果

如圖2、圖3 所示，正常組、川芎嗪各劑量組及陽性對照組中軟骨VEGF相對表達(dá)量均低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與陽性對照組相比，川芎嗪高劑量組VEGF表達(dá)量明顯低于陽性對照組(P<0.05)、而川芎嗪低劑量組其表達(dá)則高于陽性對照組(P<0.05)。

圖1 各組HE染色切片F(xiàn)ig.1 HE staining results of cartilage tissue in rats of each group

圖2 各組大鼠軟骨組織VEGF 的表達(dá)水平注：與模型組比較，*P<0.05；與陽性對照組比較，△P<0.05Fig.2 The expression level of VEGF in the cartilage of rats in different experimental groups

圖3 各組軟骨VEGF表達(dá)凝膠電泳圖Fig.3 The electrophoresis chart of VEGF expression in the cartilaginous of rats in different experimental groups

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為KOA屬于“膝痹病”、“骨痹”、“痹證”等范疇，并以肝腎虧虛為本、瘀血阻滯為標(biāo)，而發(fā)病早期以瘀血阻滯為關(guān)鍵病機(jī)。根據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)理論，結(jié)合臨床體會，我們認(rèn)為治療上早期活血化瘀、是防治KOA發(fā)病的重要環(huán)節(jié)。中藥川芎，歸肝、膽、心經(jīng)，具有活血化瘀行氣，祛風(fēng)止痛功效?！侗静菥V目》云“川芎，血中氣藥也。肝苦急，以辛補(bǔ)之，故血虛者宜之。辛以散之，故氣郁者宜之”。川芎嗪(四甲基毗嗪，ligustrazine)是從中藥川芎中提取的一種有效活性生物堿，近年相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，具有改善關(guān)節(jié)內(nèi)微循環(huán)，降低骨內(nèi)壓作用，保護(hù)和修復(fù)早期OA關(guān)節(jié)軟骨[5,6]；其能夠抑制基質(zhì)降解，抑制細(xì)胞凋亡[7]；減輕關(guān)節(jié)軟骨退變程度，并可促進(jìn)軟骨的自身修復(fù)[8]。本課題組前期研究亦發(fā)現(xiàn)川芎嗪能明顯降低骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)液中NO、PGE2的水平，對減輕OA炎癥有一定的作用[10]。本研究通過木瓜蛋白酶關(guān)節(jié)腔注射作為誘導(dǎo)大鼠膝早期骨關(guān)節(jié)炎的方法，已廣泛用于研究[11,12]。本實驗采用木瓜蛋白酶溶液關(guān)節(jié)腔注射制作大鼠KOA模型，并干預(yù)6周后行HE染色切片軟骨Mankin評分，Mankin評分越高，說明軟骨損傷程度越嚴(yán)重。其中正常組<川芎嗪高劑量組<陽性對照組<川芎嗪低劑量組<模型組低(P<0.05)。這充分說明，川芎嗪能減輕關(guān)節(jié)軟骨退變且適當(dāng)提高血藥濃度能更好的減輕關(guān)節(jié)軟骨退變程度。

正常的關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)促血管生成因子與抗血管生成因子處于動態(tài)平衡，不存在血管分布。而在OA情況下，骨/軟骨結(jié)合處及滑膜中血管生成明顯增多[13]，而其中VEGF直接或間接的參與了血管新生的每一個環(huán)節(jié)[14]。因感覺神經(jīng)隨著新生血管長入關(guān)節(jié)，血管新生既導(dǎo)致結(jié)構(gòu)的破壞，還導(dǎo)致疼痛的發(fā)生[15,16]。有研究表明，VEGF在OA中不僅能誘導(dǎo)血管生成，促進(jìn)軟骨血管侵襲，還有可能參與軟骨退化及軟骨下骨硬化的病變[17-19]。 Jansen等[20]研究發(fā)現(xiàn)，VEGF可能參與了 OA 的早期改變，并且隨著軟骨破壞的級別越高，VEGF 的表達(dá)越高。Pfander等[21]表明，關(guān)節(jié)腔內(nèi)氧張力明顯較低，并且與 OA 的嚴(yán)重程度成負(fù)相關(guān)。Hirohata、Atawia等[22,23]研究表明，VEGF是促進(jìn)血管生成的重要因子，在低氧環(huán)境下表達(dá)增高。血管生成和炎癥在OA進(jìn)程中緊密結(jié)合，炎癥可以刺激血管生成，血管生成所致的壓迫力和缺氧可以促進(jìn)炎癥，也可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞肥大和軟骨內(nèi)骨化，影響到疾病的發(fā)展和疼痛[24]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)、川芎嗪各劑量組及陽性對照組中軟骨VEGF相對表達(dá)量均低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與陽性對照組相比，川芎嗪高劑量組VEGF表達(dá)量明顯低于陽性對照組(P<0.05)、而川芎嗪低劑量組其表達(dá)則均高于陽性對照組。這表明適當(dāng)提高川芎嗪血藥濃度，可能通過下調(diào)VEGF的表達(dá)，從而減少軟骨血管侵襲，降低炎癥反應(yīng)，這可能是在某種程度上減輕關(guān)節(jié)軟骨退變、修復(fù)軟骨損傷作用的機(jī)制之一。但VEGF表達(dá)下調(diào)后能否進(jìn)一步激活軟骨細(xì)胞特異性的下游靶基因、實現(xiàn)的具體途徑如何，還有待進(jìn)一步的研究。下一階段將重點研究川芎嗪含藥血清調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的分子機(jī)制，為川芎嗪在防治OA方面，提供新的科學(xué)依據(jù)和實驗方法。