馮秀 何進鵬 華君瑞 李賀,3 石文貴,3 龍凱琴 王菊芳*

1. 蘭州大學藥學院，甘肅 蘭州 730000 2. 甘肅省空間輻射生物學重點實驗室 中國科學院近代物理研究所，甘肅 蘭州 730000 3. 中國科學院大學，北京 100049

在航天活動中，微重力導致的廢用性骨質(zhì)流失對宇航員的身體健康造成極大的威脅，成為人類長期滯留太空或進行宇宙探索的主要障礙之一。在眾多系統(tǒng)中，骨骼系統(tǒng)是保障人正常運動和形態(tài)的重要系統(tǒng)。在地球上，人類的骨骼系統(tǒng)已完全適應地心引力1 g(G-force)作用的環(huán)境。當航天器在引力場中飛行時，受到的引力約10-6～10-4g，遠遠小于地球上正常的引力，使骨代謝功能紊亂，骨量減少及骨微結(jié)構(gòu)受到損害。研究報道，當宇航員在太空飛行半年左右，微重力導致骨礦物質(zhì)的持續(xù)丟失，骨密度減少約1%，相當于絕經(jīng)后婦女1年的減少量[1]。尾吊大鼠是地基模擬微重力較好的動物模型，且已得到NASA的認可[2]。目前針對微重力導致的骨質(zhì)流失采取的各種對抗措施，除常規(guī)鍛煉和鈣劑補充外，化學藥和生物制品或多或少出現(xiàn)不良反應，如雙膦酸鹽導致胃腸道紊亂，甲狀旁腺素導致頭痛，腿抖等，而中藥治療臨床骨質(zhì)疏松有較好療效且不良作用少，因此我們探索傳統(tǒng)中藥是否有較好效果。

蛇床子素(Osthole)，又名7-甲氧基-8-異戊烯基香豆素，是一種從傘形科植物蛇床子Cnidiummonnieri(L)Cusson成熟果實提取的天然化合物。近年研究表明，蛇床子素具有抗心律失常、抗炎、抗癌及抗骨質(zhì)疏松等多方面的藥理作用[3-5]，尤其在治療骨質(zhì)疏松方面具有較大的潛力。蛇床子素不僅能夠提高OPG敲除小鼠的骨量和骨小梁參數(shù)，還對去卵巢大鼠導致的骨質(zhì)流失有良好的療效[6]。本實驗以尾吊大鼠模擬微重力誘導的骨質(zhì)流失，研究蛇床子素對模擬微重力引發(fā)的骨質(zhì)疏松大鼠骨代謝血清指標，骨密度及骨小梁微結(jié)構(gòu)的影響，為將其應用于防治空間環(huán)境下骨質(zhì)流失提供實驗依據(jù)和參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選用2月齡健康Wistar 雌性大鼠24只，體質(zhì)量約200 g，清潔級，購自蘭州大學實驗動物中心。大鼠在溫度(23±2)℃，相對濕度50%～60%，光照12 h循環(huán)的動物房中適應性飼養(yǎng)1周后開始實驗。

1.2 藥物及試劑

蛇床子素(寶雞市辰光生物科技有限公司, 貨號：HO098365)，純度>98%；血清骨特異性堿性磷酸酶(BALP，上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號：ml003415)；骨鈣素(OCN，上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號：ml002883)；抗酒石酸酸性磷酸酶-5b(TRACP-5b)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號：ml003177)；TRIzol(Life Technologies, 貨號：15596-026)；All-in-OneTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒(廣州復能基因有限公司，貨號：AORT-0020)；骨保護素(OPG，廣州復能基因有限公司，貨號：RQP049193)；核因子-κB受體激活劑配體(RANKL，廣州復能基因有限公司，貨號：RQP052161)；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH，廣州復能基因有限公司，貨號：RQP049573)。

1.3 動物造模及分組

健康大鼠適應性飼養(yǎng)1周，稱重后隨機分為3組，即對照組(Ctrl)、尾吊組(HLS)、尾吊給藥組(OST)。采用Morey-Holton方法[2]將尾吊組及尾吊給藥組大鼠尾部懸掛于籠子橫梁，使軀干與地面成30°角，身體可360°水平旋轉(zhuǎn)，前肢自由活動。

1.4 給藥過程及取材

每天上午采用灌胃的方式給藥，尾吊給藥組按10 mg/(kg·d)劑量給予蛇床子素，對照組及尾吊組給予同體積生理鹽水。飼養(yǎng)4周，末次給藥次日上午稱重后，用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，進行腹主動脈取全血，分離血清；分離肝臟、腎臟、脾臟稱重并記錄；分離后肢股骨和脛骨，剔凈周圍肌肉結(jié)締組織。血清分裝成20 μL每份，-70 ℃保存，用于ELISA分析；大鼠左側(cè)股骨用浸有生理鹽水的紗布包裹，放于-20 ℃保存，用于測骨密度(BMD)及生物力學；右側(cè)股骨用體積分數(shù)為0.75乙醇保存，進行microCT分析；左側(cè)脛骨近心端進行梯度脫水后包埋、組織切片以及Van Gieson(VG)染色處理；取大鼠右側(cè)脛骨近心端保存于液氮中，用于qRT-PCR分析。

1.5 檢測指標

1.5.1臟器指數(shù)分析：將分離的脾臟、肝臟和腎臟，用濾紙吸干殘留的血液后，稱重(g)，然后分別除以母體的體重(g)，再乘以100%，即得相應的脾臟指數(shù)、肝臟指數(shù)和腎臟指數(shù)。

1.5.2骨密度及骨生物力學檢測：將用紗布包裹的左側(cè)股骨室溫化凍后，用美國GE公司雙能X線骨密度儀(DXA)進行掃描。掃描結(jié)果用DXA自帶的enCORE軟件進行分析。將測完骨密度的股骨用島津AG-IS10KN型拉伸試驗機進行三點彎曲試驗，加壓點為中心，加載速度為10 mm/min， 支點跨距為1.5 cm。用儀器自帶的函數(shù)記錄分析軟件得出最大載荷值及彈性模量。

1.5.3血清骨代謝指標測定：將各組血清于常溫化凍后，按照ELISA試劑盒說明書在酶標儀上450 nm波長處，檢測血清中BALP、OCN、TRACP-5b水平。

1.5.4脛骨形態(tài)學觀察：取大鼠脛骨上端約1 cm，經(jīng)酒精梯度脫水、甲基丙烯酸甲酯包埋，不脫鈣切片后，進行Van Gieson 染色。用Olympus顯微鏡觀察大鼠脛骨組織切片形態(tài)特征，并進行圖片采集。

1.5.5MicroCT分析：在距離股骨遠端骨骺線2 mm處，用Skyscan 1176高分辨率計算機斷層掃描儀(microCT)進行掃描。三維掃描圖像用自帶軟件進行分析，同時比較以下骨小梁參數(shù)：骨密度(g/cm3)，骨小梁體積分數(shù)(BV/TV, %)，骨小梁分離度(Tb.Sp, mm)， 骨小梁厚度(Tb.Th, mm)，骨小梁數(shù)量(Tb.N, n/mm)。

1.5.6脛骨OPG和RANKL的mRNA表達：將脛骨近端加液氮研磨至細粉狀，用TRIzol 法提取總RNA，并用分光光度計測260 nm和280 nm的吸光值(OD值)，用OD260/OD280測定RNA純度，比值在2左右表示所提取RNA為純品。按照All-in-OneTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄和基于SYBR Green的實時定量PCR分析。實時定量PCR數(shù)據(jù)收集由BIO-RAD CFX96 PCR系統(tǒng)(美國)自帶的軟件完成，收集所有樣品的Ct值，以GAPDH作為內(nèi)參進行校準，采用2-ΔΔCt方法對目標基因OPG、RANKL mRNA表達進行分析。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 體重及脾臟、肝臟和腎臟指數(shù)

由表1可見，各組大鼠體重均無顯著變化，但是尾吊會使大鼠體重增長緩慢。脾臟、肝臟、腎臟指數(shù)在尾吊組有上升趨勢但無統(tǒng)計學意義。尾吊時給予蛇床子素后，脾臟、肝臟和腎臟指數(shù)與正常組接近。

表1 大鼠體重、脾臟、肝臟和腎臟指數(shù)變化情況Table 1 The changes of body weight and indexes of spleen, liver, and kidney n=8)

2.2 骨密度及骨生物力學指標

離體股骨骨密度檢測結(jié)果如表2所示，與對照組相比，大鼠尾吊4周后，股骨骨密度，最大載荷值和彈性模量顯著降低(P<0.05)；給予蛇床子素后，股骨骨密度和最大載荷值顯著上升(P<0.05)，一定程度上增大了股骨的彈性模量。表明蛇床子素通過增強骨密度和生物力學來增強尾吊大鼠的骨強度。

2.3 血清生化指標

由表3可見，尾吊4周后，血清中BALP和OCN較對照組均顯著下降(P<0.05)，而TRACP-5b濃度顯著上升(P<0.05)；尾吊時給予蛇床子素，可緩解尾吊導致的BALP和OCN的降低，甚至BALP可恢復近正常，而TRACP-5b顯著降低(P<0.01)。

GroupsBMD (g/cm2)Maximun load (N)Elasticity modulus(N/mm2)Ctrl0.120±0.002117.98±4.7812752.63±971.34HLS0.104±0.001??94.19±2.16?10247.00±99.43?OST0.114±0.005#113.78±7.80#11108.30±581.67

注：與Ctrl比較，*P<0.05，**P<0.01；與HLS比較，#P<0.05。

表明蛇床子素可促進成骨細胞分泌，增加血清中BALP和OCN的含量并抑制破骨細胞分泌，減少血清中TRACP-5b的含量雙向抑制尾吊大鼠導致的骨質(zhì)流失。

GroupsBALP(μg/L)OCN(ng/L)TRACP-5b(ng/mL)Ctrl30.91±2.11525.88±21.0713.98±0.42HLS23.64±1.40?442.24±15.97?15.07±0.32?OST28.72±1.96#481.41±21.9913.75±0.14##

注：與Ctrl比較，*P<0.05；與HLS比較，#P<0.05，##P<0.01。

2.4 MicroCT及脛骨形態(tài)分析

股骨遠端經(jīng)microCT 掃描后，由表4及圖1可見，尾吊組BMD、BV/TV和Tb.Th均比對照組顯著降低(P<0.01)，尾吊給藥組扭轉(zhuǎn)尾吊對骨小梁造成的損壞，表現(xiàn)在顯著提高了骨密度，骨小梁體積分數(shù)和骨小梁厚度(P<0.01)。同時，尾吊組骨小梁分離度顯著增大(P<0.01)，給予蛇床子素后，這種現(xiàn)象得到很大改善。然而，在骨小梁數(shù)量方面，盡管尾吊組和對照組沒有顯著變化，但尾吊給藥后骨小梁數(shù)量明顯增多。如圖2所示，大鼠脛骨近端VG染色切片在光鏡下觀察，也觀察到與micro CT結(jié)果一致的現(xiàn)象。對照組骨小梁縱橫交錯，呈網(wǎng)狀分布，形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，骨髓腔狹小。尾吊組骨小梁間隙增大，數(shù)量減少，呈明顯的“蜂窩狀”，甚至有些骨小梁消失不見；與尾吊組相比，OST組骨小梁密集程度明顯升高，數(shù)量也明顯增多。表明蛇床子素可以改善骨小梁微結(jié)構(gòu)，增強尾吊大鼠骨密度和骨強度。

表4 脛骨骨小梁參數(shù)的變化Table 4 The changes of trabecular bone parameters in the tibia n=8)

注：與Ctrl比較，**P<0.01；與HLS比較，#P<0.05,##P<0.01。

圖1 各組骨小梁3D重建圖Fig.1 The 3-dimensional reconstructions of trabecular bone in each groupA: Ctrl; B: HLS; C: OST

圖2 各組脛骨骨小梁形態(tài)變化(VG 染色，×40)Fig.2 The morphological changes of trabecular bone in tibia in each group (VG stain, ×40)A: Ctrl; B: HLS; C: OST

2.5 脛骨OPG和RANKL mRNA表達水平

骨質(zhì)流失的本質(zhì)是成骨細胞骨形成和破骨細胞骨吸收的不平衡。破骨細胞骨吸收主要由關鍵的破骨細胞因子RANKL促進，當其誘餌受體OPG與RANKL結(jié)合，可緩解骨吸收[7]。由圖3可見，尾吊組脛骨中OPG mRNA表達下調(diào)，RANKL mRNA表達上調(diào)，且OPG/RANKL比值顯著降低(P<0.05)，表明脛骨內(nèi)破骨吸收處于優(yōu)勢地位。尾吊時給予蛇床子素后，OPG/RANKL比值發(fā)生反轉(zhuǎn)，且具有顯著意義。表明蛇床子素可通過抑制尾吊大鼠破骨基因表達，從基因表達層面抑制模擬微重力導致的骨質(zhì)流失。

圖3 各組脛骨OPG和RANKL mRNA 表達及OPG/RANKL比值變化(A: Ctrl; B: HLS; C: OST)注：與Ctrl比較，*P<0.05；與HLS比較，#P<0.05。Fig.3 The changes of OPG, RANKL mRNA expression level and the ratio of OPG/RANKL in tibia in each group(A: Ctrl; B: HLS; C: OST)Note: vs Ctrl,*P<0.05; vs HLS,#P<0.05。

3 討論

近年來我國航空事業(yè)迅速發(fā)展，而太空飛行導致的廢用性骨質(zhì)流失卻嚴重影響了宇航員的身體健康，阻礙了宇航事業(yè)的發(fā)展，因此解決微重力誘發(fā)的骨質(zhì)流失勢在必行。尾吊大鼠模擬的骨質(zhì)流失與宇航員太空飛行時發(fā)生的骨質(zhì)流失情況極為相似，均是體液頭向分布，骨質(zhì)流失主要發(fā)生在后肢承重骨，故尾吊大鼠是地面模擬微重力誘導骨質(zhì)流失較好的動物模型[8-9]。在臨床上，骨質(zhì)流失常表現(xiàn)出不耐久坐、骨痛等癥狀，在中醫(yī)學辯證上可將骨質(zhì)流失歸屬為骨痹、腎痹、骨枯、骨萎等。《醫(yī)經(jīng)精義》：“腎藏精，精生髓，髓養(yǎng)骨，故骨者，腎之合也，髓者，精之所生也，精足則髓足，髓在骨內(nèi)，髓足則骨強”，即中醫(yī)強調(diào)腎為先天之本，精氣貯藏之所；而精氣者乃性命之根，髓、骨生化之源，故腎精足則髓足而骨強，由此腎精虛弱與骨質(zhì)流失密切相關；而中醫(yī)學對骨質(zhì)流失的治療多以補腎壯骨、祛寒益精為主[10-11]。中藥蛇床子性溫，味辛、苦，主歸腎經(jīng)，脾經(jīng)，具有溫腎壯陽、祛風燥濕、殺蟲止癢等功效，常用于治療腎虛陽痿、寒痹腰痛、濕疹陰癢等疾病，故在臨床上常將蛇床子配伍于治療腎虛陽痿、骨痹腰痛等經(jīng)方中[12]。蛇床子素為蛇床子的主要活性物質(zhì)，現(xiàn)代藥理學研究證實在體內(nèi)外實驗中均發(fā)現(xiàn)蛇床子素防治骨質(zhì)疏松有較好的效果[13]，而蛇床子素對模擬太空微重力導致的骨質(zhì)流失是否具有防治作用尚無系統(tǒng)的研究，故本次實驗通過尾吊模型模擬太空微重力導致的骨質(zhì)流失，并用蛇床子素進行干預，用以探索蛇床子素對太空微重力導致的骨質(zhì)流失的影響。

本次實驗從DXA在二維檢測了股骨骨密度，并選擇了microCT從三維角度分析了股骨骨密度及骨小梁微觀結(jié)構(gòu)的變化，進一步形象闡釋了大鼠發(fā)生骨質(zhì)流失時骨小梁數(shù)量變少，間隙變大，導致骨密度降低，脆性增強的現(xiàn)象。與此同時，VG染色與microCT 3D重建圖像相輔相成，在視覺上展示了尾吊誘發(fā)骨質(zhì)流失及蛇床子素治療具有良好的防護效果。除此之外，我們選擇BALP、OCN和TRACP-5b分別作為血清中骨形成和骨吸收指標。BALP由成骨細胞分泌，是總堿性磷酸酶的重要部分，當肝功能正常時，肝臟和骨骼來源的堿性磷酸酶各占血液總堿性磷酸酶的一半。骨源性堿性磷酸酶與總堿性磷酸酶呈正相關，可部分反映骨形成狀態(tài)。OCN是骨基質(zhì)中含量最豐富和骨形成過程產(chǎn)生較晚的標志物。TRACP-5b是由細胞分泌的非膠原蛋白，是反映破骨細胞活性的標志物，且血清TRACP-5b與骨吸收水平呈正相關[14]。我們發(fā)現(xiàn)尾吊大鼠血清中BALP顯著降低，TRACP-5b顯著升高，這與Fahmy等[15]研究大鼠切除卵巢誘導的骨質(zhì)疏松結(jié)果相符，提示尾吊大鼠會誘發(fā)骨質(zhì)流失。尾吊時給予蛇床子素可扭轉(zhuǎn)尾吊誘發(fā)的骨代謝指標的變化。OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)是調(diào)節(jié)破骨細胞生成和抗骨吸收作用的重要途徑之一，而OPG和RANKL主要由成骨細胞和骨髓基質(zhì)細胞分泌，調(diào)控二者的表達水平?jīng)Q定了對破骨細胞的調(diào)控方向[16]。在脛骨OPG和RANKL mRNA 表達水平分析過程中，我們發(fā)現(xiàn)尾吊大鼠脛骨內(nèi)OPG mRNA表達下調(diào)，RANKL mRNA表達上調(diào)，這可能是由于尾吊刺激成骨細胞過度表達RANKL而降低OPG表達，使RANKL與RANK結(jié)合，啟動破骨細胞的分化和功能活性，骨吸收過程活躍，這一現(xiàn)象與Li等[17]的結(jié)果一致。尾吊組大鼠聯(lián)合蛇床子素處理后扭轉(zhuǎn)了脛骨內(nèi)OPG和RANKL的表達，使OPG/RANKL比值較單獨尾吊組顯著增加。另外，我們發(fā)現(xiàn)尾吊組大鼠較正常組大鼠脾臟、肝臟和腎臟均出現(xiàn)輕微腫大現(xiàn)象，尾吊時給予蛇床子素后可以緩解這一現(xiàn)象，可能與《本草經(jīng)疏》中“蛇床子苦能除濕,溫能散寒,辛能潤腎,甘能益脾”的藥理作用有關，但仍需要進一步驗證。

總而言之，蛇床子素可通過抑制骨吸收和促進骨形成來達到預防模擬微重力誘發(fā)的骨質(zhì)流失。這表明了在預防宇航員骨量減少方面的新的潛在可行策略。