梅海軍，劉建明

南通大學(xué)附屬醫(yī)院普通外科，南通 226001

腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells, CSCs)是指腫瘤組織中一小部分亞群細(xì)胞，具有極強(qiáng)的成瘤能力，是腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)[1-2]。深入研究CSCs的生物學(xué)特性，探討調(diào)控CSCs的生物學(xué)行為機(jī)制，能夠?yàn)槟[瘤的臨床治療提供新的參考依據(jù)。腫瘤細(xì)胞懸浮成球?qū)嶒?yàn)被認(rèn)為是獲取腫瘤干細(xì)胞的方法之一。

懸浮球培養(yǎng)法已在許多實(shí)體腫瘤中成功分離出腫瘤干細(xì)胞，但該方法能否成功培育出胃癌腫瘤干細(xì)胞仍不明確。因此，本研究選用胃癌細(xì)胞株MKN45在無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，從中分離出懸浮球細(xì)胞，檢測懸浮球細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)志物ATP結(jié)合盒蛋白亞家族2(ATP-binding cassette sub-family G member 2, ABCG2)的表達(dá)情況，探討懸浮球培養(yǎng)法制備ABCG2陽性表達(dá)胃癌腫瘤干細(xì)胞的可行性。

1 資料與方法

1.1 主要材料及試劑 人胃癌細(xì)胞株MKN45購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫，青霉素/鏈霉素購于Thermo公司，人成纖維細(xì)胞生長因子2(FGF-2)及表皮生長因子(EGF)購自Sigma公司，ABCG2抗體購自Abcam公司，RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、4×蛋白上樣緩沖液、1.5 mol/LTris-HCl pH 8.8、1 mol/LTris-HCl(pH 6.8)、TEMED、增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒均購自碧云天公司；甘氨酸(電泳級)、過硫酸胺(APS)均購自Sigma-Aldrich公司。RNA提取試劑試劑盒(RNAiso Plus)購自TaKaRa公司，MultiScribe Reverse Transcriptase購自Applied Biosystems公司；SYBRGreen PCR Supermix購自Bio-Rad公司，Diethypyrocarbonate(DEPC)水購自碧云天公司。

1.2 胃癌細(xì)胞培養(yǎng) MKN45細(xì)胞培養(yǎng)在37℃、含5% CO2的環(huán)境中，培養(yǎng)液均為RPMI 1640培養(yǎng)基，含10%胎牛血清(FBS)，以及青霉素62.5 mg/L、鏈霉素100 mg/L，添加人FGF-2濃度20 ng/mL及EGF濃度100 ng/mL。細(xì)胞生長于T-75組織培養(yǎng)曲頸瓶中，2 d更換培養(yǎng)基1次，觀察懸浮球形成狀態(tài)，每孔約100個細(xì)胞，14 d后在顯微鏡下放大40及100倍觀察懸浮球形成情況。懸浮球長到約300～600個細(xì)胞時，用滴管將球體吹開，細(xì)胞密度約為1 000/mL。在96孔低吸附板中，每孔加入100 μL單細(xì)胞懸液，14 d后觀察懸浮球形成狀態(tài)，原代貼壁培養(yǎng)細(xì)胞作為對照組進(jìn)行觀察。

1.3 實(shí)時熒光定量 PCR每1×106細(xì)胞中，加入1 mL TRIzol試劑，用1 mL移液槍吹至液體澄清且無細(xì)胞團(tuán)塊并轉(zhuǎn)移入1.5 mL EP管中，按照TaKaRa公司總RNA提取試劑盒操作提取總RNA，并進(jìn)行RNA定量。按照RT-PCR試劑盒將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照Thermal Cycler DiceTMReal Time System(TaKaRa Code：TP800)使用說明書要求進(jìn)行PCR試驗(yàn)操作。待測基因引物序列如下，ABCG2-F：5′-TGA GGG TTT GGA ACT GTG G-3′；ABCG2-R：5′-GAT TCT GAC GCA CAC CTG G-3′；GAPDH-F：5′-GGC ATC CTG GGC TAC ACT-3′；GAPDH-R：5′-CCA CCA CCC TGT TGC TGT-3′。定量PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃ 5 s，Tm 15 s，72℃ 30 s，45個循環(huán)；熔解曲線分析：95℃ 15 s，70℃ 15 s。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用Livak法半定量分析RT-PCR檢測結(jié)果。

1.4 Western印跡法檢測蛋白表達(dá)水平 PBS洗滌細(xì)胞1次后，置于冰板上，用細(xì)胞刮子將細(xì)胞刮下收集，8 000 r/min×1 min離心得到細(xì)胞沉淀，每20 μL體積中加入100 μL RIPA細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min 后，超聲破碎5次，每次2 s，15 000 r/min×10 min離心得到上清即為提取到的總蛋白樣品。BCA法測定蛋白含量。蛋白樣品按體積比3∶1加入上樣緩沖液并煮沸5 min。制備8%SDS-PAGE，對樣品進(jìn)行電泳分離。電泳分離后，進(jìn)行濕電轉(zhuǎn)移，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。PVDF膜在含5%脫脂奶粉的TBST溶液中封閉1 h后，4℃孵育一抗過夜，相應(yīng)二抗室溫孵育1 h，ECL顯影，Bio-Rad凝膠成像儀成像。

2 結(jié) 果

2.1 胃癌細(xì)胞懸浮球體的形成 在無血清培養(yǎng)基中，胃癌MKN45細(xì)胞培養(yǎng)4 d后開始逐漸形成細(xì)胞球體形狀，繼續(xù)培養(yǎng)，8～14 d形成較為完整的懸浮球體，球體中心細(xì)胞密度變大。繼續(xù)培養(yǎng)至21 d，形成完整的懸浮球體，球體中心胃癌細(xì)胞密度增大，排列緊密(圖1)。將第1代懸浮球體用滴管吹散后，在無血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，顯微鏡下觀察，培養(yǎng)基中形成的細(xì)胞球體進(jìn)一步增多，成球率高達(dá)(36.12±7.53)%。而原代貼壁培養(yǎng)細(xì)胞組成球率為(4.10±1.21)%，兩組成球率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 胃癌細(xì)胞MKN45無血清培養(yǎng)21 d后形成的懸浮球體

2.2 懸浮球細(xì)胞ABCG2的表達(dá)水平 實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果(圖2A)顯示：懸浮球細(xì)胞ABCG2 mRNA表達(dá)水平高于原代貼壁細(xì)胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Western印跡結(jié)果(圖2B)顯示：懸浮球細(xì)胞ABCG2蛋白表達(dá)水平高于原代貼壁培養(yǎng)細(xì)胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 原代貼壁細(xì)胞及懸浮球體細(xì)胞ABCG2的表達(dá)

3 討 論

癌細(xì)胞的廣泛侵襲和轉(zhuǎn)移是胃癌患者最主要的死因，特別是難以控制的遠(yuǎn)隔重要臟器的轉(zhuǎn)移[3]。CSCs在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中扮演的角色至關(guān)重要。ABCG2是ABC超家族成員之一，又被稱為乳腺癌耐藥蛋白，該蛋白作為外源性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白發(fā)揮作用，對化療藥物(包括米托蒽醌和喜樹堿藥物)的多藥耐藥起重要作用[4]。其在胎盤中表達(dá)顯著增高，在母體循環(huán)中具有保護(hù)胎兒免受外來物質(zhì)影響的作用，在肝臟和腎臟上皮細(xì)胞的頂端膜中，能夠增強(qiáng)外源性物質(zhì)的排泄[5]。在哺乳期的乳腺中，它具有將核黃素和生物素等分泌到乳汁中的作用；在腎臟和胃腸道中，它具有促進(jìn)尿酸排泄的作用[6-7]。

ABCG2基因在許多惡性腫瘤細(xì)胞質(zhì)膜上高表達(dá)，從而導(dǎo)致惡性腫瘤細(xì)胞能夠?qū)⒖鼓[瘤藥物泵出細(xì)胞外產(chǎn)生抗藥性[8-9]。在對膠質(zhì)瘤、黑素瘤等惡性腫瘤患者進(jìn)行治療的過程中，加入針對不同ABCG2突變體的拮抗劑可能會出現(xiàn)更好的療效。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，ABCG2在膠質(zhì)瘤、黑素瘤等腫瘤干細(xì)胞細(xì)胞膜上的表達(dá)特異性增高，提示ABCG2可能會成為這些腫瘤干細(xì)胞陽性篩選的潛在標(biāo)志物[10]。

本研究結(jié)果顯示，胃癌細(xì)胞株MKN45在含有FGF-2及EGF的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)21 d，能夠形成完整的懸浮球體，成球率明顯高于原代貼壁細(xì)胞。

懸浮球體細(xì)胞內(nèi)的ABCG2蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)水平均顯著高于原代貼壁細(xì)胞，提示采用懸浮球培養(yǎng)法在胃癌細(xì)胞株MKN45中培養(yǎng)的懸浮球體細(xì)胞具有CSCs特性。該方法有望成為胃癌干細(xì)胞研究新的造模方法，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。