杜霞，陳衛(wèi)平，袁干軍，鄺丙娣

（1.江西農業(yè)大學食品科學與工程學院，江西南昌330045；2.江西農業(yè)大學生物科學與工程學院，江西南昌330045）

甲基萘醌（menaquinone，MK），又稱為維生素 K2，由甲基萘醌母環(huán)和3號位上異戊二烯側鏈組成，為一類2-甲基-1，4-萘醌同系物的總稱[1]。根據其側鏈異戊二烯結構數目不同，可分為14種，用MK-n表示（如圖1）。MK最早由丹麥化學家Henfik Dam在研究膽固醇代謝時發(fā)現[2]，結構不穩(wěn)定，對光和堿敏感，易被氧化，不溶于水，易溶于有機溶劑[3]。MK作為人體所必須的脂溶性營養(yǎng)素之一，具有重要生理活性。MK為將谷氨酸殘基轉化為γ羥基谷氨酸的羥化酶合成的重要輔助因子，與Ca+鰲合以促進血液凝固[4]。同時有效預防骨質疏松功效[5-6]。MK能降低外界對大腦新型膠質細胞的損傷，可用于治療心血管疾病[7]，癌癥[8]，帕金森[9]等疾病。目前MK生產方式主要為化學合成，此方法具有成本高，產物產量低，反應條件嚴格等劣勢，相對而言，微生物生產以產量高，成本低，反應溫和，副產物少等優(yōu)點吸引眾多研究者的目光[10]。

自然界中許多芽孢桿菌呼吸過程能產生甲基萘醌[11]，如解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）[12]，納豆芽孢桿菌（Bacillus natto）[13-14]，黃桿菌（Flavobacterium sp.）[15]，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[16]，遲緩芽孢桿菌（Bacillus lentus）[17]，蘇云金臘樣芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis）[18]等，其中尤其是納豆芽孢桿菌MK產量較高，得到國內外的廣泛注意和研究[19]。豆類食品中富含維生素K2，并且適宜各種芽孢桿菌生長。據此學者們從各種豆類食品中篩選出產MK菌株，如日本納豆[17-18]，云南香草豆[20]，韓國清曲豆醬[21]等。在我國，豆豉是一種以豆類為原料發(fā)酵生產的傳統(tǒng)食品，風味獨特，營養(yǎng)價值高[22]。本研究以江西特產發(fā)酵型豆豉為原材料，利用耐熱性分離芽孢桿菌。菌株發(fā)酵液經離心，冷凍干燥，萃取純化處理后，進行高效液相色譜（high performance liquid chromatograph，HPLC）檢測，篩選得到目標菌株并鑒定。為MK微生物生產提供一株優(yōu)良菌株。試驗結果表明，此篩選方案切實可行，為產MK菌株篩選提供了可行性方法。

圖1 MK-n化學結構式Fig.1 The structural formula of MK-n

1 材料與方法

1.1 材料

樣品來源：江西產發(fā)酵型豆豉。

1.2 培養(yǎng)基

初篩培養(yǎng)基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl0.5g，瓊脂1.5 g，水100 mL，pH 7.4。種子培養(yǎng)基：葡萄糖1.5 g，蛋白胨 1.5 g，KH2PO40.1 g，K2HPO4·3H2O 0.25 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，水 100 mL，pH7.0～7.2。發(fā)酵培養(yǎng)基：甘油0.5 g，豆粉 4 g，K2HPO4·3H2O 0.05 g，KH2PO40.1 g，NaCl 0.3 g，水 100 mL，pH7.0～7.2。

1.3 試劑

MK-7標準品（≥99.8%）：美國ChromaDex公司；異丙醇、甲醇（色譜純）：美國TEDIA公司；氯仿、四氫呋喃、戊二醛、乙醇（分析純）：上海國藥試劑公司。

1.4 儀器與設備

高壓蒸汽滅菌鍋（MLS-3751L）：日本松下健康醫(yī)療器械株式會社；高效液相色譜儀（Waters e2695）、檢測器（2998ePDA）、C18色譜柱高效色譜柱（460 mm×250 mm，5 μm）：美國 Waters公司；DNA 抽提試劑盒：生物工程（上海）股份有限公司；PCR儀：美國Bio-Rad公司；高速冷凍離心機（GL-21M）：湘儀離心機儀器有限公司；超聲波細胞粉碎機（XINYI-IID）：寧波新藝超聲設備有限公司；真空冷凍干燥機（FD-10-50）：北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；場發(fā)射掃描電鏡（JSM-6701F）：日本電子株式會社；飛行時間高分辨質譜（AB Sciex 5600）：美國安捷倫科技公司。

1.5 試驗方法

1.5.1 芽孢桿菌篩選

無菌條件下稱取5 g豆豉，于50 mL無菌生理鹽水，80℃水浴30 min。震蕩混勻，取1 mL菌液于9 mL生理鹽水，稀釋至適宜濃度。采用涂布平板法，分離出單菌落。對單菌落進行革蘭氏染色和光學顯微鏡觀察菌落特征，選擇革蘭氏染色陽性桿狀菌株，即芽孢桿菌，保存以備下一步試驗。

1.5.2 搖瓶發(fā)酵復篩

取初篩菌株，接兩環(huán)于250 mL三角瓶中，裝瓶量為100 mL種子培養(yǎng)基進行菌種活化，條件為：37℃，110 r/min，培養(yǎng)24 h。按照3%（體積分數）接種量接種于裝有100 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在37℃，110 r/min條件下培養(yǎng)3 d。

1.5.3 發(fā)酵產物分析

發(fā)酵液處理：發(fā)酵液在4℃，6 000 r/min高速離心15 min，重復3遍，收集下層沉淀菌體。置于-80℃冰箱8 h，真空冷凍干燥1.5 d，得到干燥菌體。按照有機溶液∶菌體體積比為35∶1加入，有機溶劑為甲醇與異丙醇等量混合，細胞破碎處理（超聲2 s，間隙3 s）12 min，減壓抽濾，收集萃取液。在25℃條件旋轉蒸發(fā)，得到濃縮樣品。

產物分析：將濃縮樣品溶解于上機液（異丙醇∶四氫呋喃體積比為9∶1）中，準確定容至2 mL，過0.22 μm微孔濾膜。HPLC檢測分析。對發(fā)酵液進行初步分析，與標準品保留時間比較，確定是否含有MK-7。利用峰面積定量分析，篩選得到產量較高菌株。

HPLC色譜條件：流動相甲醇∶異丁醇體積比為4∶1，流速1 mL/min，柱溫40℃。檢測器PDA（光電二極管矩陣檢測器，檢測波長245 nm），進樣量為20 μL。

1.5.4 產物液相色譜-質譜聯用（liquid chromatographmass spectrometer，LC-MS）驗證

發(fā)酵液提取樣品經HPLC分離，質譜掃描檢測，驗證菌株次級代謝產物中MK產物結構。

產物制備：通過高效液相色譜柱分離，根據產物出峰時間在高效液相色譜儀檢測器后的出口收集樣品約500 mL。旋轉蒸發(fā)濃縮，再溶解于異丙醇中，定容至2 mL，以備LC-MS檢測。

LC-MS質譜條件：加速電壓15 kV，加速速率30 kHz，ESI電噴霧離子源，負離子模式掃描，離子源溫度550℃，檢測器為TDC40 GHz。

1.5.5 菌株鑒定

形態(tài)學觀察：將所篩選菌株活化后稀釋涂布至平板上觀察菌落形態(tài)，接種環(huán)挑取菌株純培養(yǎng)物革蘭氏染色，在光學顯微鏡下觀察。

電鏡掃描（scanning electron microscope，SEM）觀察：取適量種子液涂至無菌載玻片上，用生理鹽水沖洗2遍，2.5%戊二醛浸泡固定8 h。梯度乙醇洗脫（濃度依次為10%，30%，50%，70%，90%），最后用100%乙醇沖洗2遍[23]，空氣中晾干，噴金，電鏡觀察。

生理生化鑒定：參照《伯杰氏手冊》[24]對目標菌株進行生理生化試驗。

分子生物學鑒定：利用DNA抽提試劑盒提取基因組，使用細菌通用引物進行PCR擴增。PCR循環(huán)條件為94℃預變性4 min，94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1min，進行30個循環(huán)，72℃修復延伸10 min，4℃終止反應。取PCR產物上樣1%瓊脂糖凝膠，150V、100 mA、20 min電泳觀察。再將擴增產物送至生物工程（上海）股份有限公司測序。

同源性分析：將序列上傳NCBI數據庫，進行blast同源序列檢測，獲得同源性較高菌株16S rDNA序列。應用BioEdit軟件分析各16S rDNA序列之間的同源性，并通過Clustalx 1.83及MEGA 6.0軟件，根據相似相鄰法則（Neighbor-Joining）構建同源性系統(tǒng)發(fā)育樹。將序列提交至NCBI網站，獲得登錄ID號。

1.5.6 菌株發(fā)酵進程監(jiān)測

菌株活化后接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，在37℃，110 r/min條件下，發(fā)酵6 d。每隔24小時測定菌體干重和MK-7產量，繪制發(fā)酵進程監(jiān)測曲線。

2 結果與分析

2.1 菌株篩選結果

豆豉菌液經過80℃水浴30 min后，利用芽孢桿菌的耐熱性進行篩選。對平板涂布法挑選出的單菌落進行革蘭氏染色和形態(tài)學觀察，挑選染色結果為革蘭氏陽性，顯微結構為桿狀菌株保存，分離得到29株所需菌株。將初篩芽孢桿菌按照上述條件進行搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵液經HPLC檢測，在245 nm波長下，出峰時間為22.5 min左右，色譜圖如圖2所示。

圖2 菌株產物HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of the strain production

與標準品MK-7保留時間相同菌株共有16株，菌株篩選結果見表1。

由表1可知，DC-1菌株MK產量較高，在同等條件下發(fā)酵培養(yǎng)3 d，MK-7產量可達0.317 mg/L。因此選擇菌株DC-1為目標菌株，以該菌株為后續(xù)研究的出發(fā)菌株。

2.2 菌株DC-1發(fā)酵產物LC-MS分析結果

菌株發(fā)酵產物LC-MS圖譜總離子流圖與質譜圖見圖3。

表1 產MK-7菌株篩選結果Table 1 Screening results of the MK-7 producers

圖3 菌株發(fā)酵產物LC-MS圖譜Fig.3 Results of fermentation product by LC-MS

由總離子流圖3（a），質量色譜圖3（b）可知，相對豐度最高的物質質荷比（m/z）為648.506 1，其產物與MK-7分子量648.496 0相吻合，因此可以推斷出DC-1菌株在液相色譜22.5 min處洗脫峰對應的產物為本研究目的產物MK。

2.3 菌種鑒定

2.3.1 菌株DC-1形態(tài)觀察結果

宏觀形態(tài)觀察：菌株純培養(yǎng)物觀察如圖4。

由圖4可知，菌落淡黃色，表面無光澤，有褶皺，中間草帽狀突起，邊緣不規(guī)則，質地松軟黏稠，有臭雞蛋氣味。

微觀形態(tài)觀察：菌株DC-1微觀形態(tài)圖如圖5。

圖4 菌株DC-1宏觀菌落形態(tài)圖Fig.4 Macroscopic colony characteristics of the strain DC-1

圖5 菌株DC-1微觀形態(tài)圖Fig.5 Microscopic colony characteristics of the strain DC-1

由圖5結果可知，顯微鏡觀察革蘭氏染色結果為陽性，桿狀呈鏈狀排布。掃描電子顯微鏡（SEM）利用電子束掃描樣品得到高分辨率的三維結構圖，由圖可以看出DC-1菌株為長條桿狀，長度約為1 μm～2.5 μm。

2.3.2 菌株生理生化試驗結果

菌株DC-1生理生化試驗結果見表2。

表2 DC-1生理生化試驗結果Table 2 Biological characteristics of the strain DC-1

2.3.3 菌株分子生物學鑒定結果

PCR產物測得基因序列數目為1 421 bp?；蛐蛄性诨驍祿欤℅enaBank）中blast比對分析，發(fā)現與菌株Bacillus subtilis HMJ-2和Bacillus subtilis IARI-NIAW1-13同源性高達99%以上。結合該菌的形態(tài)學和生理生化特征，鑒定為枯草芽孢桿菌，命名為Bacillus subtilis DC-1。將該菌的16s rDNA序列提交至GenaBank數據庫，得到序列ID為MG266437。在NCBI數據庫中下載相似度高菌株序列，利用MEGE6.0軟件，構建同源性系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖6所示。

圖6 DC-1菌株同源性分析樹Fig.6 Homology phylogenetic tree of the strain DC-1

2.3.4 菌株發(fā)酵進程監(jiān)測曲線

在37℃，搖床轉速為110 r/min條件，Bacillus subtilis DC-1發(fā)酵培養(yǎng)6 d，每隔1天測定發(fā)酵液中MK-7含量和菌體干重，繪制發(fā)酵進程監(jiān)測曲線如圖7。

圖7 Bacillus subtilis DC-1發(fā)酵進程監(jiān)測曲線Fig.7 Fermentation curve of Bacillus subtilis DC-1

由圖7可知發(fā)酵前4天，隨時間增長，菌體生物量增加，發(fā)酵液中MK-7含量呈較快速度增長。而發(fā)酵第4天后，菌體生物量增加緩慢，發(fā)酵液中MK-7含量下降，試驗結果與李拖平等的研究結果一致[25]，可能由于MK結構不穩(wěn)定，在發(fā)酵液中分解，導致發(fā)酵液中MK-7產量降低。由試驗結果可知，菌體發(fā)酵過程第4天，MK-7產量最高，為0.416 mg/L。

3 結論

本研究通過平板初篩和搖瓶篩選相結合的方法從發(fā)酵豆豉中篩選出1株產MK菌株DC-1。經過形態(tài)學觀察，生理生化，分子生物學試驗與分析，鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。利用HPLC和LC-MS對菌株發(fā)酵液分析，確定菌株產物為MK-7。Bacillus subtilis DC-1在37℃，110 r/min條件下發(fā)酵4 d，MK-7產量為0.416 mg/L。該菌株具有較強研究意義和廣闊應用前景，可為后續(xù)菌種誘變選育，發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化提供原材料，并為從微生物發(fā)酵方向獲得MK提供重要依據。