金鑰，孫延斌，梅連瑞，李經(jīng)緯

（1.天津市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)技術(shù)研究院，天津300308；2.天津津?yàn)I華測(cè)產(chǎn)品檢測(cè)中心有限公司，天津300300）

近年來，水產(chǎn)品的消費(fèi)呈逐年遞增趨勢(shì)[1]。獸藥的濫用、誤用、不遵守休藥期等諸多問題，是導(dǎo)致水產(chǎn)品安全問題、引起貿(mào)易爭(zhēng)端的主要原因[2]。本試驗(yàn)檢測(cè)的大環(huán)內(nèi)酯類、林可胺類、硝基咪唑類藥物所針對(duì)水產(chǎn)品的最大殘留限量（maximum residue limit，MRLs）并不完全，而目前國(guó)標(biāo)針對(duì)于水產(chǎn)樣品的前處理也存在一定的缺陷，具體的取樣依據(jù)不夠完善[3]；檢測(cè)項(xiàng)目的篩查能力不足[4]。（ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）[5-9]能滿足獸藥多殘留的儀器檢測(cè)要求，而前處理就成為獸藥殘留檢測(cè)的關(guān)鍵步驟，（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe，QuEChERS）方法[10-14]用于獸藥殘留的前處理工作時(shí)，不僅保證前處理操作過程簡(jiǎn)便、耗時(shí)短、有良好的凈化能力，還能保證方法的回收率、精密度。

因此，本研究通過QuEChERS結(jié)合UPLC-MS/MS建立同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中14種獸藥殘留的檢測(cè)方法，完善水產(chǎn)品獸藥殘留的監(jiān)控體系，同時(shí)也為獸藥殘留分析提供方法依據(jù)，從而建立適合現(xiàn)代檢測(cè)需求的快速、高效、綠色環(huán)保、成本低廉的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀（AB Triple Quad 6500四級(jí)桿質(zhì)譜儀）：美國(guó)AB公司；Agilent 1290超高效液相色譜儀：美國(guó)安捷倫公司；Wters BEH C18、Waters BEH HILIC色譜柱：美國(guó)Waters公司；Agilent Eclipse Plus C18RRHD色譜柱：美國(guó)安捷倫公司。

超純水：屈臣氏；乙腈、甲醇（色譜純）：德國(guó)默克公司；甲酸（ACS純）：美國(guó)西格瑪公司；C18填料、PSA 填料：天津博納艾杰爾科技有限公司；醋酸、無水硫酸鈉、無水硫酸鎂、醋酸鈉、氯化鈉（分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（4-硝基咪唑、甲硝唑、地美硝唑、2-5-硝基咪唑、阿奇霉素、林可霉素、竹桃霉素、替米考星、紅霉素、泰樂菌素、吉他霉素、克拉霉素、羅紅霉素、螺旋霉素，所有藥物純度均大于99%）：德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱量標(biāo)準(zhǔn)品，乙腈定容，分別配制濃度范圍在0.2 mg/mL～1 mg/mL之間的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備單標(biāo)；標(biāo)準(zhǔn)中間儲(chǔ)備液：將同一類藥物的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備單標(biāo)配制成一類藥物的中間液，乙腈定容，配制成10 μg/mL中間液后再稀釋成500 ng/mL中間液；混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：用初始流動(dòng)相對(duì)中間液進(jìn)行稀釋，稀釋成所需濃度。標(biāo)準(zhǔn)溶液均為避光冷藏保存。

所需其他溶液：0.1%甲酸水溶液；0.1%甲酸-乙腈溶液；樣品提取溶液（5%醋酸-乙腈溶液）；樣品復(fù)溶液（初始流動(dòng)相）。

1.2 樣品前處理

魚類取背脊部魚肉進(jìn)行破碎，貝類、蝦類取可食用部分進(jìn)行破碎，置于-18℃冰箱保存，稱取解凍恢復(fù)至室溫樣品2 g（精確到0.1 mg）置于50 mL離心管內(nèi)，加入1 mL內(nèi)標(biāo)工作液、2 mL超純水，使樣品充分分散，加入10 mL 5%醋酸乙腈，同時(shí)加入4 g Na2SO4和1 g NaCl混勻，5 000 r/min，離心 5 min；移取上清液置于另一裝有150 mg C18、50 mg PSA（乙二胺-N-丙基填料，N-（N-propyl）ethylenediamine） 的 15 mL 離心管中，渦旋混勻使樣品與填料充分接觸，5 000 r/min離心5 min后移取6 mL上清液，上清液在35℃下氮吹至近干；用1 mL初始流動(dòng)相復(fù)溶，過0.22 μm濾膜，待上機(jī)檢測(cè)。

1.3 儀器條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱為 Waters BEH C18，1.7 μm，2.1mm×100 mm；流動(dòng)相A為水、B為乙腈（均添加0.1%甲酸），洗脫程序見表1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件

正離子模式掃描（ESI+）；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)采集方式（MRM）；霧化氣壓力及輔助氣壓力均為4.14×105Pa；氣簾氣壓力：2.07×105Pa；離子源溫度：550℃；電噴霧電壓：5 500 V；化合物的離子對(duì)參數(shù)、碰撞電壓、去簇電壓等參數(shù)見表2。

表2 14種化合物的質(zhì)譜采集參數(shù)Table 2 Mass condition of 14 compounds

續(xù)表2 14種化合物的質(zhì)譜采集參數(shù)Continue table 2 Mass condition of 14 compounds

圖1 14種組分混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatogram of 14 analytes mixed standard solution

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

色譜條件的優(yōu)化旨在待測(cè)物之間的有效分離及目標(biāo)化合物與雜質(zhì)之間的有效分離。色譜柱考慮了Waters BEH HILIC、Agilent Eclipse Plus C18RRHD 及Waters BEH C18色譜柱，結(jié)果顯示，Waters BEH C18是本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)效果較好的柱子。

有機(jī)相通常選擇甲醇、乙腈及甲醇與乙腈的混合物，乙腈與水混合對(duì)色譜柱能起到保護(hù)作用，而且乙腈有比甲醇強(qiáng)的洗脫能力，峰型好，柱效高等特點(diǎn)[15]，所以選擇乙腈作為有機(jī)相；化合物發(fā)生電離時(shí)，需要一定的陽離子為其提供質(zhì)子來源，結(jié)果顯示，添加0.1%甲酸對(duì)化合物的分離效果最優(yōu)，可以獲得尖且高的峰型，選擇分別在水相及有機(jī)相添加0.1%甲酸作為流動(dòng)相。圖1為QuEChERS結(jié)合UPLC-MS/MS建立的方法所得出的（multi-reaction monitoring mode，MRM）譜圖。

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的優(yōu)化

由于乙腈的提取效果優(yōu)于甲醇、乙酸乙酯，且乙腈不會(huì)提取出較多的基質(zhì)雜質(zhì)[16]，因此選取乙腈為QuEChERS的提取溶劑；試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)樣品隨著乙腈的加入而變的堅(jiān)硬且成團(tuán)，不利于待測(cè)化合物的提取，采用了先加水再用乙腈提取的方法；提取劑的酸度也需要優(yōu)化，考慮了乙腈、1%醋酸乙腈、5%醋酸乙腈分別作為提取劑，結(jié)果顯示，5%醋酸乙腈為提取劑時(shí)，14種獸藥的平均回收率獲得了最優(yōu)的結(jié)果。綜合考慮，選擇5%醋酸乙腈為本方法的提取溶劑，結(jié)果如圖2。

圖2 提取劑酸度的優(yōu)化Fig.2 Effect of extraction solvent acidity

2.2.2 凈化條件的優(yōu)化

凈化是去除提取溶液中雜質(zhì)，利于后續(xù)的檢測(cè)工作[17]。鹽析的作用是去除蛋白質(zhì)等基質(zhì)雜質(zhì)，常用的鹽析劑有NaAc和NaCl，吸水劑有MgSO4和Na2SO4，結(jié)果見圖3。

圖3 鹽析劑、吸水劑的選擇Fig.3 Choice of salting-out and absorbing agent

NaCl和Na2SO4組合時(shí)，硝基咪唑類及林可胺類化合物的均為最高，大環(huán)內(nèi)酯類為次高，最后選擇NaCl和Na2SO4；QuEChERs技術(shù)是通過固相分散萃取技術(shù)對(duì)提取液進(jìn)行凈化，即需要對(duì)雜質(zhì)有較強(qiáng)的吸附能力，而對(duì)目標(biāo)化合物的吸附能力較弱，常用的吸附劑主要有PSA、C18、中性氧化鋁，水產(chǎn)品中含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪類物質(zhì)，故本研究選取PSA、C18對(duì)水產(chǎn)品進(jìn)行凈化；本試驗(yàn)考慮了PSA、C18的不同使用量，結(jié)果如圖4。

圖4 吸附劑比例的優(yōu)化Fig.4 Effect of adsorbent ratio

圖4結(jié)果表明，使用50 mg PSA+150 mg C18組合時(shí)，樣品溶液澄清，基質(zhì)干擾較小，回收率顯著。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)

在UPLC-MS/MS分析中，基質(zhì)效應(yīng)一般認(rèn)為是與目標(biāo)化合物共流出的雜質(zhì)對(duì)目標(biāo)化合物離子化過程的影響[18]，但基質(zhì)效應(yīng)是很難完全消除的。試驗(yàn)最終采用基質(zhì)匹配曲線來對(duì)樣品中的獸藥殘留進(jìn)行定量，以抵消基質(zhì)效應(yīng)影響。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 基質(zhì)曲線與檢測(cè)限

以沒有添加任何藥物的鯽魚為陰性樣品。以信噪比S/N≥10為L(zhǎng)OQ，信噪比S/N≥3為L(zhǎng)OD，求得14種化合物的相關(guān)系數(shù)均大于0.99，檢出限（limit of determination，LOD）和定量限（limit of quantity，LOQ）分別在 0.01 μg/kg～0.13 μg/kg和 0.02 μg/kg～0.44 μg/kg 范圍內(nèi)，見表3。

表3 14種獸藥的定量限、檢出限、回歸方程、線性系數(shù)、回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Limit of detection（LODs），limit of quantitation（LOQs），regression equations，correlation coefficients，recoveries and RSDs of 14 veterinary drugs

續(xù)表3 14種獸藥的定量限、檢出限、回歸方程、線性系數(shù)、回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Continue table 3 Limit of detection（LODs），limit of quantitation（LOQs），regression equations，correlation coefficients，recoveries and RSDs of 14 veterinary drugs

2.4.2 回收率與精密度

試驗(yàn)中選取1、2、5 μg/kg 3個(gè)濃度水平進(jìn)行添加，每個(gè)濃度重復(fù)6次平行測(cè)定，14種獸藥的回收情況為69.66%～97.25%，標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.55%～10.06%，見表3。

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

本試驗(yàn)水產(chǎn)品樣品的采集依據(jù)SC/T 3016-2004《中華人民共和國(guó)水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行采樣。樣品主要為天津地區(qū)養(yǎng)殖水產(chǎn)品，樣品包括淡水魚斑點(diǎn)叉尾鮰、大鱗鲃、加州鱸魚、鯉魚、花鰱魚、草魚；海水魚點(diǎn)帶石斑魚、珍珠龍膽石斑魚、半滑舌鰨、大菱鲆；貝類為菲律賓蛤仔、毛蚶；蝦類為南美白對(duì)蝦。天津地區(qū)養(yǎng)殖水產(chǎn)品中14種獸藥均未檢出。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過QuEChERs結(jié)合UPLC-MS/MS對(duì)14種獸藥進(jìn)行檢測(cè)，采用5%醋酸乙腈提取，PSA、C18凈化，水：乙腈（均含有0.1%甲酸）為流動(dòng)相，Waters BEH C18，1.7 μm為色譜柱，建立了UPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中14種獸藥殘留的分析檢測(cè)方法。本方法試驗(yàn)檢測(cè)周期短、前處理方法簡(jiǎn)單，無需特殊實(shí)驗(yàn)裝置，且試驗(yàn)成本低，為大批量水產(chǎn)品獸藥殘留檢測(cè)提供了簡(jiǎn)便可靠的方法。