楊生輝 莫安薇 王 琳

(海南省人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，?？?570000)

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一[1]。盡管目前治療手段有所改善，但是由于肺癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)分子機(jī)制尚未被完全闡明，肺癌的死亡率仍然居高不下[2]。肺癌分為小細(xì)胞肺癌與非小細(xì)胞肺癌,非小細(xì)胞肺癌包括大細(xì)胞癌(15%～30%)、鱗癌(20%～25%)、腺癌(50%～60%)，其5年生存率均低于5%[3]。肺癌治療困難歸因于缺乏有效的治療藥物。

中醫(yī)藥學(xué)歷史悠久，源遠(yuǎn)流長，以辨證施治的整體理論應(yīng)用于各種疾病的中醫(yī)臨床治療中[4]。中醫(yī)藥在改善生活質(zhì)量、減弱放化療毒副反應(yīng)、延長患者存活時間等方面都有著西醫(yī)治療無法比擬的優(yōu)勢[5,6]。在江浙一帶，中草藥貓人參是一種臨床常用藥，有祛風(fēng)除濕、消腫散癤等多種功效，經(jīng)常與其他中藥配伍，治療腫瘤及麻風(fēng)病等各種疾病[7]?？屏_索酸(Corosolic acid,CA)是應(yīng)用多相色譜分離技術(shù)從貓人參中提取獲得的化合物，分子式：C30H48O4，分子結(jié)構(gòu)如圖1[8]。近年研究表明，CA對血糖水平、肝癌細(xì)胞和白血病細(xì)胞都有一定程度的抑制作用[9-12]。然而CA是否對肺癌細(xì)胞有生長抑制作用尚未闡明。

Hippo信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演著重要的角色[13]。Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated protein，YAP)在細(xì)胞內(nèi)調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄共激活過程，在肺癌患者的血清和組織中表達(dá)量都明顯升高，促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移[14,15]。臨床研究表明某些臨床常用藥物(如維替泊芬)就是通過調(diào)控Hippo-YAP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性來抑制腫瘤的發(fā)生、生長和轉(zhuǎn)移[16]。本研究試圖闡明科羅索酸對非小細(xì)胞肺癌是否具有抑制作用，并對CA是否通過Hippo-YAP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作為靶點對肺癌細(xì)胞起抑制作用進(jìn)行探討，對于臨床非小細(xì)胞肺癌的防治可提供新的治療策略和依據(jù)。

圖1 科羅索酸的化學(xué)分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Corosolic acid molecular structure

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要抗體 YAP(美國Abcam公司);GAPDH(美國Abcam公司)。

1.1.2主要試劑 胎牛血清FBS(美國Gibco公司)；科羅索酸(美國Abcam公司)；Western blot/IP裂解液(海門市碧云天生物技術(shù)研究所)； Caspase-Glo 3/7 Kit(美國Promega公司);RT Reagent Kit(美國TaKaRa公司)；蛋白合成抑制劑CHX(瑞士Roche公司)；MTT Kit(美國Sigma公司)。

1.1.3主要儀器 CO2培養(yǎng)箱(日本三洋電氣公司)；雙人超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備公司)；倒置相差顯微鏡(德國Leica公司)；電泳儀(上海天能科技有限公司)；多功能酶標(biāo)儀(德國 Biometra 公司);實時熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司)；高速離心機(jī)(美國Thermo公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將A549細(xì)胞株在完全培養(yǎng)基(100 mg/L鏈霉素、100 U/ml青霉素10%胎牛血清)，5%CO2，37℃飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在細(xì)胞鋪滿瓶底時，用含EDTA的胰酶消化后，進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.2.2MTT法檢測CA對肺癌A549細(xì)胞增殖的影響 將A549細(xì)胞以每孔10 000個接種于48孔板中，加入不同CA濃度(0、20、40、60、80、160 μmol/L)的培養(yǎng)基200 μl。24 h后每孔加入5 mg/ml，200 μl MTT溶液，當(dāng)出現(xiàn)肉眼可見的深色沉淀時即終止反應(yīng)；每孔加入150 μl DMSO溶液，在避光搖床上震蕩使深色結(jié)晶充分溶解；隨后用酶標(biāo)儀在595 nm波長處檢測各孔吸光值(OD)，并計算6個復(fù)孔的平均值。細(xì)胞存活率(%)=實驗組OD均值/空白對照組OD均值×100%。

1.2.3Caspase 3/7活性檢測CA對A549細(xì)胞凋亡的影響 將A549細(xì)胞以10 000個/孔接種于96孔板中，加入不同CA濃度(0、20、40、60、80、160 μmol/L)的培養(yǎng)基200 μl。24 h后加入100 μl Caspase-Glo 3/7試劑混合液。然后用移液槍吹打細(xì)胞至脫離板壁，在37℃培養(yǎng)箱中孵育30 min。用酶標(biāo)儀測定每孔的OD值，實際測得的Caspase3/7活性數(shù)值即為每孔的OD值減去空白對照的OD值。細(xì)胞凋亡率(%)=實驗組OD值/空白對照組OD值×100%。

1.2.4Western blot(WB)檢測CA對肺癌細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響 將收集到的細(xì)胞進(jìn)行裂解后，應(yīng)用BCA法測定蛋白濃度，并計算上樣量。按照 25 g/泳道加入對應(yīng)樣本的蛋白和5×蛋白Loading Buffer，電泳后使用NC膜進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)移。隨后將NC膜依次放于一抗和二抗稀釋液中，分別37℃孵育1 h，使用ECL發(fā)光試劑盒在暗室內(nèi)進(jìn)行顯影、定影等過程。最后用掃描儀將條帶掃描，應(yīng)用Image J軟件分析并統(tǒng)計各條帶的灰度值。

1.2.5免疫熒光實驗對YAP的細(xì)胞定位進(jìn)行檢測 將待測細(xì)胞以1×104個/孔放入，細(xì)胞爬片過夜。4%多聚甲醛將細(xì)胞固定后，封閉(1.5 ml FBS，50 μl Triton X-100和5%山羊血清，用PBS配至50 ml)1 h。封閉液稀釋一抗和二抗，分別37℃孵育1 h。DAPI封片后在共聚焦或熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.6RT-PCR檢測YAP的mRNA表達(dá) 用Trizol抽提液抽提細(xì)胞總RNA，YAP上游引物5′GCTTGTTCCCATCCATCAGGAAG3′，下游引物5′GCAGGTTGGGAGATGGCAAAGAC3′；內(nèi)參GAPDH基因上游基因5′-GAAGGTGATAGTCGGAGTCA-3′，下游基因5′-GAAGATGGTGCTGGGATTTC-3′。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增實驗。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃ 30 s，95℃ 30 s進(jìn)行40個循環(huán)。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，記錄Ct，用2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達(dá)水平，實驗重復(fù)6次，取均值。

1.2.7CHX實驗檢測YAP蛋白的降解速率及半衰期 將CHX(50 μg/ml)加入A549細(xì)胞株抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白的產(chǎn)生，間隔0、1、2、4、8、24 h后分別收集細(xì)胞，直至將所有細(xì)胞收集完畢。進(jìn)行Western blot檢測YAP的表達(dá)量，最后根據(jù)不同時間的蛋白含量繪制蛋白降解曲線。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)都采用統(tǒng)計軟件SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，實驗均進(jìn)行至少3次以上。各組間如果方差不齊則采用非參數(shù)法比較。兩組間比較采用t檢驗，兩樣本率的比較采用χ2檢驗。并設(shè)定P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1CA抑制肺癌細(xì)胞A549的增殖 為了探究CA對A549細(xì)胞增殖的影響，我們將CA溶解于甲醇中配置成不同濃度的藥物培養(yǎng)基，采用不同濃度的CA(0、20、40、60、80、160 μmol/L)作用于A549細(xì)胞24 h后，用MTT實驗檢測CA對A549細(xì)胞增殖方面的影響。結(jié)果如圖2所示，在不同濃度的CA作用下細(xì)胞的存活率與CA的濃度呈負(fù)相關(guān)性，20、40、60、80、160 μmol/L的CA藥物培養(yǎng)液中存活的活細(xì)胞分別為對照組(只加甲醇處理)的85.6%、51.1%、22.4%、11.7%、6.8%，由此可見CA能抑制肺癌細(xì)胞增殖，并呈濃度依賴性。以無CA培養(yǎng)基中生長的肺癌細(xì)胞作為對照組，CA濃度為40 μmol/L，24 h后肺癌細(xì)胞存活率約為正常細(xì)胞的一半，因此MTT實驗結(jié)果顯示，CA對A549細(xì)胞的24 h 半抑制濃度約為40 μmol/L。

2.2CA促進(jìn)A549肺癌細(xì)胞的凋亡 為了進(jìn)一步確認(rèn)CA對肺癌細(xì)胞的抑制作用，我們采用不同濃度的CA(0、20、40、60、80、160 μmol/L)分別處理A549肺癌細(xì)胞24 h后，用Western blot實驗在蛋白水平上對凋亡蛋白酶作用底物進(jìn)行了檢測，并且檢測Caspase3/7的酶活性。

如圖3所示，我們首先通過Western blot技術(shù)檢測了Caspase底物水平，不同濃度的CA作用于A549肺癌細(xì)胞后，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著CA濃度增加，Caspase底物的表達(dá)水平逐步增加，在CA濃度為80 μmol/L時，Caspase底物濃度達(dá)到最大值，在濃度約為40 μmol/L時，凋亡底物濃度達(dá)到最大值的一半。

隨后，我們用Caspase-3/7試劑盒對Caspase-3/7酶活性進(jìn)行檢測。結(jié)果如圖4所示，隨著CA濃度的增大，Caspase-3/7的酶活性逐漸增加，在CA濃度約為80 μmol/L時酶活性達(dá)到最大值，在CA濃度約為40 μmol/L，酶活性達(dá)到最大濃度的一半。值得注意的是Caspase-3/7活性分析以及Western blot實驗結(jié)果都顯示：在CA濃度為160 μmol/L時，Caspase-3/7的酶活性以及凋亡蛋白酶底物濃度都顯著降低，我們猜測這是由于CA濃度過高，藥物培養(yǎng)基過度毒性導(dǎo)致肺癌細(xì)胞大量死亡，由于肺癌細(xì)胞數(shù)量的急劇降低，導(dǎo)致Caspase底物的表達(dá)水平以及Caspase-3/7的酶活性均出現(xiàn)顯著降低的現(xiàn)象。

2.3CA抑制A549肺癌細(xì)胞的Hippo信號通路 接下來我們?yōu)榱嗣鞔_CA是否以Hippo信號通路為靶點調(diào)控肺癌細(xì)胞的增殖與凋亡，我們首先用40 μmol/L的CA處理A549肺癌細(xì)胞(對照組用等量的甲醇處理)24 h后，Western blot實驗檢測兩組細(xì)胞YAP表達(dá)水平。結(jié)果如圖5所示，發(fā)現(xiàn)CA處理過后的肺癌細(xì)胞中的YAP表達(dá)水平顯著降低，明顯低于對照組。

圖2 MTT法檢測細(xì)胞存活率Fig.2 MTT assay was used to detect cell viability

圖3 Western blot實驗檢測Caspase底物表達(dá)水平Fig.3 Expression level of Caspase substrate was detected by Western blot

圖4 Caspase-3/7活性分析實驗檢測Caspase-3/7酶活性Fig.4 Caspase-3/7 activity analysis of Caspase-3/7 enzyme activity

圖5 Western blot實驗檢測YAP蛋白表達(dá)水平Fig.5 Expression level of YAP protein was detected by Western blot

圖6 免疫熒光實驗對YAP在肺癌細(xì)胞內(nèi)的定位Fig.6 Localization of YAP in lung cancer cells by immunofluorescence assay

隨后，我們應(yīng)用免疫熒光試驗對A549肺癌細(xì)胞的YAP進(jìn)行定位檢測，結(jié)果如圖6所示，對照組YAP定位于細(xì)胞核中，但在CA(40 μmol/L)處理24 h后，YAP出現(xiàn)從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞漿中的現(xiàn)象。不僅如此，實驗結(jié)果還明顯顯示出，CA處理肺癌細(xì)胞后，YAP的熒光強(qiáng)度與對照組相比明顯減弱。由以上結(jié)果我們推斷CA對肺癌細(xì)胞的抑制作用可能是通過Hippo信號通路調(diào)控的。

圖7 PCR檢測CA對YAP mRNA水平的影響Fig.7 Effect of CA on YAP mRNA level was detected by PCR

圖8 YAP蛋白半衰期變化Fig.8 Half-life of YAP protein

2.4CA通過促進(jìn)YAP的蛋白降解下調(diào)其表達(dá) 為了明確CA下調(diào)YAP表達(dá)的機(jī)制，隨后我們檢測了CA作用于肺癌細(xì)胞后YAP的mRNA 表達(dá)情況，結(jié)果如圖7所示，40 μmol/L的CA對肺癌細(xì)胞中YAP的mRNA表達(dá)并沒有明顯的影響，因此我們排除了CA通過抑制YAP基因轉(zhuǎn)錄下調(diào)YAP蛋白表達(dá)量的可能性。

接下來，我們采用CHX實驗確定CA對于YAP蛋白降解半衰期的影響。我們對A549細(xì)胞株進(jìn)行CA(40 μmol/L)處理后，再加入終濃度為50 μg/ml的CHX，并分別在加藥后0、1、4、8、24 h收集細(xì)胞，進(jìn)行Western blot檢測YAP表達(dá)水平，并根據(jù)結(jié)果計算灰度值，繪制YAP降解曲線，如圖8所示，CA能夠明顯縮短YAP的半衰期，即CA在蛋白水平上促進(jìn)了YAP的降解，進(jìn)而導(dǎo)致YAP表達(dá)量下調(diào)。

3 討論

全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，肺癌是男性癌癥死亡的主要原因，也是女性癌癥死亡的第二大原因，每年約有180萬的新發(fā)病例和160萬的死亡案例[17,18]。肺癌的發(fā)病原因可能與吸煙、大氣污染、老齡化、遺傳等多種因素密切相關(guān)[19]。由于在肺癌發(fā)病的早期階段缺乏特異性臨床癥狀，大約40%的肺癌患者在確診時即已發(fā)生遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致許多患者喪失手術(shù)切除機(jī)會，因此目前化療是治療肺癌的主要手段[20]。尋找特異性強(qiáng)、敏感性高、毒性小、抗腫瘤作用強(qiáng)的新型化學(xué)藥物是肺癌臨床治療的下一步研究方向。

CA是中草藥貓人參中提取的主要藥效成分。近年來，CA在降血糖、消炎、抗氧化應(yīng)激及抗腫瘤等方面都有諸多研究。Li等[21]認(rèn)為，CA通過促進(jìn)漿膜上的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4(GLUT4)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞外膜上，使細(xì)胞對葡萄糖的攝取利用率增加，從而降低血糖水平；Xu等[22]發(fā)現(xiàn)CA通過上調(diào)Bax的表達(dá)，增加Bax/Bcl-2的比率，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯。然而關(guān)于CA對肺癌細(xì)胞的影響還尚未有報道。本實驗探究了CA 對肺癌細(xì)胞株A549增殖和凋亡的影響，首先我們發(fā)現(xiàn)CA抑制A549的增殖，促進(jìn)其凋亡，并且均呈劑量依賴性。此外我們還確認(rèn)了CA作用于A549細(xì)胞時的半抑制濃度，該濃度的確認(rèn)能夠指導(dǎo)后續(xù)實驗的用藥濃度。

Hippo-YAP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在果蠅體內(nèi)最先發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞中調(diào)節(jié)各類轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡。該通路一旦發(fā)生調(diào)控異常，就會誘導(dǎo)YAP介導(dǎo)的多種下游靶基因激活并調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，從而對患者的治療和預(yù)后產(chǎn)生影響[23]。Wang等[24]發(fā)現(xiàn)在肺癌細(xì)胞中過表達(dá)YAP蛋白可顯著促進(jìn)細(xì)胞的增殖能力。Zhang等[25]認(rèn)為Hippo信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路新發(fā)現(xiàn)的成員VGLL4能與YAP競爭性結(jié)合下游轉(zhuǎn)錄因子TEADs，進(jìn)而抑制YAP的生物學(xué)作用，抑制了肺癌細(xì)胞的增殖和腫瘤的生長；Yuan等[26]研究發(fā)現(xiàn)Hippo信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中YAP的異常激活可促進(jìn)YAP下游基因Survivin、CTGF等生長基因的表達(dá)，促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖和腫瘤的生長。根據(jù)以上研究結(jié)果，我們有理由認(rèn)為Hippo-YAP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能成為肺癌治療的新型潛在靶點。接下來我們試圖探究CA對肺癌細(xì)胞A549的抑制是否通過Hippo-YAP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)的。實驗結(jié)果顯示CA能明顯下調(diào)YAP在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)并促進(jìn)YAP由胞核轉(zhuǎn)移到胞漿。Kim等[27]研究報道，在肺癌細(xì)胞中，YAP主要定位在細(xì)胞核中，通過調(diào)控多種轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮其促癌作用。實驗結(jié)果顯示在CA作用后，YAP主要在細(xì)胞漿中表達(dá)。由此我們猜測CA通過促進(jìn)YAP出核，切斷了其在細(xì)胞核中的作用途徑，無法實現(xiàn)其對肺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的調(diào)控，從而促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。

為了進(jìn)一步確認(rèn)肺癌細(xì)胞A549中YAP下調(diào)的機(jī)制，我們進(jìn)行了YAP的蛋白質(zhì)層面和mRNA層面的分析。我們發(fā)現(xiàn)CA對肺癌細(xì)胞YAP的mRNA表達(dá)并沒有明顯的影響。但是通過對YAP蛋白半衰期的檢測，我們發(fā)現(xiàn)CA處理肺癌細(xì)胞后，YAP蛋白的半衰期明顯縮短。因此，我們證實CA并非通過抑制YAP基因的轉(zhuǎn)錄來下調(diào)YAP的表達(dá)量，而是通過促進(jìn)YAP蛋白降解來抑制YAP蛋白的表達(dá)。

上述實驗結(jié)果表明，CA是一個潛在的抗肺癌藥物，可能通過Hippo-YAP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路起抑制作用，為以后CA用于肺癌的治療提供了理論依據(jù)，為肺癌的預(yù)防和分子治療方面提供了新的思路和方向。但是關(guān)于本實驗中YAP蛋白降解的精確分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步探究?？偟膩碚f，本實驗揭示科羅索酸對肺癌細(xì)胞的抑制作用及其機(jī)制，對篩選新的抗肺癌免疫新型藥物等方面具有十分重要的意義。