韋迎娜 韓圣娜

(海南省第三人民醫(yī)院心內(nèi)科，三亞 572000)

心肌炎是一種由病毒感染、物理及化學(xué)等因素導(dǎo)致的心臟炎癥性病變，會(huì)造成致命性傷害，尤其是對(duì)年輕人。病毒感染是引發(fā)心肌炎最最要的原因，病毒感染會(huì)對(duì)心肌細(xì)胞造成直接損害，引發(fā)炎癥反應(yīng)從而增強(qiáng)心肌毒性和相關(guān)的發(fā)病率[1-3]。據(jù)統(tǒng)計(jì)約21%的心肌炎患者會(huì)發(fā)展成擴(kuò)張性心肌病，心肌炎是引起擴(kuò)張性心肌病和心臟猝死的常見(jiàn)原因[4-6]。開(kāi)發(fā)心肌炎治療方法對(duì)人類健康事業(yè)具有重要意義。目前發(fā)現(xiàn)了一些天然產(chǎn)物具有改善心肌炎的效果[7]。槲皮素(化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1)屬于黃酮醇類物質(zhì)，是蔬菜、水果和茶的重要抗氧化劑，在洋蔥、蘋果及草莓中含量尤其豐富[8]。大量研究表明槲皮素具有抗氧化、抗炎、降血糖等多種生物學(xué)活性[9]。流行病學(xué)研究表明，在膳食中攝入更多的槲皮素可降低心血管疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[10]。目前槲皮素已被廣泛用作營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑和植物化學(xué)藥物，有利于癌癥、糖尿病/肥胖及腦血管疾病的治療[11-14]。槲皮素在心肌炎中的研究十分有限，尤其對(duì)病毒性心肌炎中的作用尚不清楚。本研究主要目的是探索槲皮素對(duì)病毒性心肌炎新生小鼠氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑 75只BALB/c新生小鼠購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。槲皮素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。CVB3病毒由上海中山醫(yī)院病毒性心臟病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。Accu-check活力血糖儀購(gòu)自美國(guó)羅氏公司。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海索萊寶生物科技有限公司。ELISA試劑盒[IL-1β,IL-6,誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)]購(gòu)自美國(guó)R&D公司。抗TGF-β1、抗p-NF-κB P65和抗TNF-α抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組及處理 小鼠隨機(jī)分為3組：未感染正常組(normal)；模型組(CVB3)；治療組[CVB3+Quercetin(50 mg/kg)]，每組25只。模型組和治療組腹腔注射0.1 ml 含1×10半數(shù)組織細(xì)胞感染量(TCID50)CVB3的病毒液,正常組腹腔注射等量不含病毒的培養(yǎng)液。同時(shí)治療組灌胃給藥槲皮素(50 mg/kg)，正常組和模型組予以等量蒸餾水灌胃。

圖1 槲皮素化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structural formula of quercetin

1.2.2血糖濃度檢測(cè) CVB3感染3、6、9、12 d 時(shí)采集乳鼠尾部血液，用全血通過(guò)羅氏Accu-check活力血糖儀檢測(cè)各組乳鼠血糖濃度。

1.2.3氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè) CVB3感染3、6、9、12 d 時(shí)，收集待測(cè)乳鼠血清，利用SOD、MDA和LDH試劑盒按照說(shuō)明書對(duì)乳鼠血清SOD、MDA和LDH水平進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4ELISA檢測(cè)炎癥因子水平 CVB3感染3、6、9、12 d時(shí)，依照ELISA試劑盒說(shuō)明書對(duì)乳鼠血清炎癥因子水平進(jìn)行檢測(cè)，首先將樣品加入反應(yīng)孔，37℃孵育45 min，洗滌后加入生物素標(biāo)記的抗-IgG抗體，37℃孵育30 min，然后加鏈霉親和素-HRP 混勻，37℃反應(yīng)30 min。最后加入顯色劑避光顯色15 min，加終止液終止反應(yīng)，450 nm處檢測(cè)吸光值。

1.2.5蛋白印跡 收集各組乳鼠待測(cè)心肌細(xì)胞，首先用PBS清洗3次，加入含蛋白酶抑制劑的裂解液進(jìn)行裂解提取總蛋白，100℃變性5 min。然后等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%的BSA封閉1 h后加入相應(yīng)的一抗，4℃過(guò)夜孵育。第2天加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1.5 h。最后加入發(fā)光液于凝膠成像儀進(jìn)行曝光拍照并統(tǒng)計(jì)灰度值計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS16.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩兩比較用獨(dú)立的t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1槲皮素可提高CVB3誘導(dǎo)的病毒性心肌炎新生小鼠存活率 如圖2所示，CVB3感染3 d后模型組乳鼠存活率急劇下降，明顯低于正常組(P<0.05)。與模型組相比，治療組乳鼠存活率升高(P<0.05)。CVB3感染5 d以后模型組乳鼠存活率穩(wěn)定在40%以下，治療組乳鼠存活率則維持在80%以上。上述結(jié)果表明，槲皮素可提高CVB3誘導(dǎo)的病毒性心肌炎新生小鼠存活率。

2.2槲皮素會(huì)降低CVB3誘導(dǎo)的病毒性心肌炎新生小鼠心臟重量/體重比值 圖3顯示，CVB3感染3 d后模型組乳鼠心臟重量/體重比值(Heart weight/body weight,HW/BW)明顯高于正常組(P<0.05)。與模型組相比，治療組乳鼠HW/BW比值降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨著CVB3感染天數(shù)的增加，模型組乳鼠HW/BW比值也在上升，CVB3感染9 d后治療組乳鼠HW/BW比值明顯低于模型組(P<0.05)。由此可見(jiàn)，槲皮素可抑制CVB3誘導(dǎo)的病毒性心肌炎新生小鼠HW/BW比值的升高。

2.3槲皮素可降低CVB3誘導(dǎo)的病毒性心肌炎新生小鼠血糖濃度 由圖4可知，CVB3感染3 d時(shí)模型組乳鼠血糖濃度達(dá)到峰值，之后緩慢降低，維持在8 mmol/L左右，明顯高于正常組(P<0.05)。治療組乳鼠血糖濃度也是在CVB3感染 3 d 時(shí)達(dá)到峰值，但明顯低于模型組(P<0.05)。以上結(jié)果說(shuō)明，槲皮素處理會(huì)降低CVB3誘導(dǎo)的病毒性心肌炎新生小鼠血糖濃度。

2.4槲皮素會(huì)減輕CVB3誘導(dǎo)的病毒性心肌炎新生小鼠氧化應(yīng)激損傷 如圖5所示，CVB3感染6 d和9 d時(shí)，模型組乳鼠SOD水平明顯低于正常組，MDA和LDH水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。與模型組相比，CVB3感染6 d和9 d時(shí)治療組乳鼠SOD水平明顯升高，MDA和LDH水平明顯下降(P<0.05)。上述結(jié)果表明，槲皮素可改善CVB3誘導(dǎo)的病毒性心肌炎新生小鼠氧化應(yīng)激損傷。

圖2 小鼠生存曲線Fig.2 Survival curve of miceNote:Compared with normal group,*.P<0.05；compared with model group,#.P<0.05.

圖3 乳鼠心臟重量/體重比值(HW/BW)Fig.3 Rate of heart weight/body weight(HW/BW)of neonatal ratNote:Compared with normal group,*.P<0.05；compared with model group,#.P<0.05.

2.5槲皮素可減弱CVB3誘導(dǎo)的病毒性心肌炎新生小鼠炎癥反應(yīng) 圖6顯示，模型組乳鼠IL-1β和IL-6水平在CVB3感染6 d時(shí)急劇升高，且明顯高于正常組(P<0.05)。治療組乳鼠IL-1β和IL-6水平在CVB3感染6 d時(shí)則明顯低于模型組(P<0.05)。與正常組相比，模型組乳鼠iNOS水平在CVB3感染6 d和9 d時(shí)明顯升高(P<0.05)。治療組乳鼠iNOS水平在CVB3感染6 d和9 d時(shí)明顯低于模型組(P<0.05)。由此可見(jiàn)，槲皮素會(huì)降低CVB3誘導(dǎo)的病毒性心肌炎新生小鼠炎癥反應(yīng)。

圖4 血糖濃度Fig.4 Concentration of blood sugarNote:Compared with normal group,*.P<0.05;compared with model group,#.P<0.05.

圖5 氧化指標(biāo)檢測(cè)Fig.5 Oxidative index detectionNote:Compared with normal group,*.P<0.05;compared with model group,#.P<0.05.

圖6 ELISA檢測(cè)炎癥因子Fig.6 Levels of inflammatory factor were detected by ELISANote:Compared with normal group,*.P<0.05；compared with model group,#.P<0.05.

圖7 蛋白印跡檢測(cè)NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.7 Expression of NF-κB pathway related proteins was tested by Western blotNote:Compared with normal group,*.P<0.05；compared with model group,#.P<0.05.

2.6槲皮素會(huì)抑制NF-κB通路的激活 如圖7所示，模型組乳鼠TGF-β1和p-NF-κB P65表達(dá)水平在CVB3感染6、9和12 d時(shí)明顯高于正常組(P<0.05)。治療組乳鼠TGF-β1和p-NF-κB P65表達(dá)水平在CVB3感染6、9和12 d時(shí)明顯低于模型組(P<0.05)。與正常組相比，模型組乳鼠TNF-α表達(dá)水平在CVB3感染6 d和9 d時(shí)明顯升高(P<0.05)。治療組乳鼠在CVB3感染6 d和9 d時(shí)TNF-α表達(dá)水平明顯低于模型組(P<0.05)。以上結(jié)果說(shuō)明，槲皮素可通過(guò)抑制NF-κB通路的激活減輕CVB3誘導(dǎo)的病毒性心肌炎新生小鼠炎癥反應(yīng)。

3 討論

目前針對(duì)心肌炎的治療主要是輔助支持療法，另外還有免疫療法和抗病毒治療，但這些方法治療效果并不理想[15-17]。氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是心肌炎的主要病征[2,3]。大量文獻(xiàn)報(bào)道了許多天然產(chǎn)物在改善心肌損傷及減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)方面具有積極的作用。

近年來(lái)植物提取物在疾病治療方面受到了越來(lái)越多的關(guān)注。有研究表明豆蔻提取物可提高CVB3誘導(dǎo)的病毒性心肌炎小鼠3周存活率[18]。來(lái)源于尾葉香茶菜提取物的ORI2可提高CVB3誘導(dǎo)的病毒性心肌炎大鼠2周存活率[19]。據(jù)報(bào)道蜜花豆和掌葉大黃提取物均提高CVB3誘導(dǎo)的病毒性心肌炎小鼠30 d存活率[20,21]。有研究發(fā)現(xiàn)芹黃素可抑制自身免疫性心肌炎小鼠HW/BW比值的升高，改善心臟功能[22]。據(jù)報(bào)道黃連素具有降低自身免疫性心肌炎大鼠HW/BW比值的功能[23]。有數(shù)據(jù)顯示槲皮素具有降低糖尿病大鼠及食源性肥胖小鼠血糖水平的功效[24,25]。本研究結(jié)果顯示，在CVB3誘導(dǎo)的病毒性心肌炎新生小鼠中，槲皮素可提高新生小鼠存活率，抑制HW/BW比值的升高，降低血糖濃度。

氧化應(yīng)激在心肌炎進(jìn)程中十分重要，降低氧化應(yīng)激有利于心肌炎的治療[26]。有研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)蒴黃麻葉提取物可抑制砒霜誘導(dǎo)的心肌炎大鼠SOD活性降低及MDA水平的升高，改善氧化應(yīng)激損傷[27]。據(jù)報(bào)道槲皮素可抑制H2O2誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞H9C2中LDH的釋放[28]。有研究表明槲皮素可抑制蛛網(wǎng)膜下腔出血誘導(dǎo)的大鼠大腦皮層MDA水平的升高[29]。Das等[30]發(fā)現(xiàn)槲皮素可提高短期高脂飲食小鼠SOD活性，降低MDA水平。本文結(jié)果表明，槲皮素可提高CVB3誘導(dǎo)的病毒性心肌炎新生小鼠SOD活性，降低MDA和LDH水平，減輕氧化應(yīng)激損傷。

炎癥反應(yīng)是心肌炎主要病癥之一，各種炎癥因子在心肌炎中起著重要作用[31]。許多植物提取物都具有抗炎的功效。在CVB3誘導(dǎo)的病毒性心肌炎小鼠中，三七總皂苷可抑制血清促炎因子IL-6 和TNF-α釋放[32]。據(jù)報(bào)道紅景天苷可降低脂多糖誘導(dǎo)的敗血癥性心肌炎大鼠IL-1β和IL-6的分泌[33]。Mito等[34]研究表明在自身免疫性心肌炎大鼠中，姜黃素可降低iNOS的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)。在高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖癥小鼠中，槲皮素處理會(huì)減弱IL-1β和IL-6的分泌[35]。在鎳誘導(dǎo)的肝損傷小鼠中，槲皮素可降低IL-1β和iNOS水平[36]。有研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可抑制四氯化碳誘導(dǎo)的肝損傷小鼠IL-1β和iNOS水平的升高[37]。本研究結(jié)果顯示，槲皮素可降低CVB3誘導(dǎo)的病毒性心肌炎新生小鼠IL-1β、IL-6和iNOS水平，抑制炎癥反應(yīng)。

NF-κB信號(hào)通路在各類疾病中起著重要的調(diào)控作用[38,39]。Zempo等[40]發(fā)現(xiàn)來(lái)源于可可豆提取物的多酚物質(zhì)可降低自身免疫性心肌炎小鼠p-NF-κB P65蛋白水平，抑制NF-κB 炎癥通路的活化。在CVB3誘導(dǎo)的病毒性心肌炎小鼠中，姜黃素可抑制NF-κB P65激活[41]。大量研究表明槲皮素可通過(guò)NF-κB介導(dǎo)的炎癥通路發(fā)揮抗炎作用[42]。Messer等[43]發(fā)現(xiàn)槲皮素可降低乳鼠成骨細(xì)胞NF-κB P65磷酸化水平。據(jù)報(bào)道在佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠中，槲皮素可抑制NF-κB P65活化[44]。本文結(jié)果顯示，槲皮素可降低CVB3誘導(dǎo)的病毒性心肌炎新生小鼠TGF-β1、p-NF-κB P65和TNF-α蛋白水平，抑制NF-κB 通路激活。

本研究表明，在CVB3誘導(dǎo)的病毒性心肌炎新生小鼠中，槲皮素可提高新生小鼠存活率，抑制HW/BW比值和血糖濃度的升高，增強(qiáng)SOD活性，降低MDA和LDH水平，抑制IL-1β、IL-6和iNOS分泌，減弱TGF-β1、p-NF-κB P65和TNF-α表達(dá)。綜上所述，槲皮素可減輕CVB3誘導(dǎo)的新生小鼠病毒性心肌炎氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)。下一步計(jì)劃研究槲皮素對(duì)病毒性心肌炎新生小鼠心臟功能的影響，為心肌炎治療提供新的方向。